《The Journal of Nervous and Mental Disease》：Multi-omics Analysis Reveals Distinct Changes in the Cellular Composition of Vulvar Lichen Sclerosus
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本文利用单细胞RNA测序和脂质代谢组学技术，系统比较了外阴硬化性苔藓与正常皮肤的差异。研究发现VLS组织中T细胞（特别是GZMB/GZMK和GNLY/XCL1亚群）增多，而成纤维细胞、角质形成细胞和黑素细胞减少，并伴有代谢和炎症基因的异常活化。细胞通讯分析表明T细胞与成纤维细胞间相互作用增强，免疫荧光结果证实GZMB、IFN-γ和TNF-β等促炎因子表达显著上调。研究表明，VLS中T细胞的组成变化通过诱导正常皮肤细胞凋亡，破坏皮肤组织，在疾病炎症发展中扮演关键角色。
材料与方法
本研究的样本来自复旦大学附属妇产科医院外阴门诊在2022年10月至12月期间经病理诊断确诊为外阴硬化性苔藓的患者。研究者采集了病变组织及病灶周围的正常皮肤作为自身对照。其中，4例患者的样本用于单细胞RNA测序分析。所有患者在活检前6个月内均未接受过局部或全身性皮质类固醇或免疫抑制治疗。单细胞测序方面，组织样本经过消化处理形成细胞悬液，通过10x Genomics Chromium平台生成凝胶珠乳滴并进行文库构建，随后在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序。使用Cell Ranger流程将测序读数比对到人类基因组，并利用Seurat软件进行后续分析，包括质控、标准化、细胞整合和聚类。此外，研究还对15例VLS样本进行了靶向脂质代谢组学分析，并使用免疫荧光技术对差异表达基因进行了验证。统计分析方法采用GraphPad Prism 9软件，组间比较使用Student t检验，P值小于0.05被认为具有统计学显著性。
结果
病灶组织中T细胞丰度增加，而黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞丰度降低
经过质量控制去除双联体后，共检测到48,806个细胞。初步聚类鉴定出13个细胞簇，包括T细胞、巨噬细胞/单核细胞、肥大细胞、角质形成细胞、内皮细胞、淋巴内皮细胞、成纤维细胞、黑素细胞、神经内分泌细胞、肌肉细胞和红细胞。计算每位患者各细胞簇的相对丰度后发现，所有4位患者的T细胞数量均有所增加。同时，在VLS样本中也观察到黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞的减少。通过去卷积分析批量RNA测序数据，预测了9名患者中T细胞、黑素细胞、成纤维细胞和角质形成细胞的相对丰度，结果显示T细胞显著增加而黑素细胞减少，这与单细胞RNA测序分析结果一致。
不同细胞类型的差异基因表达分析
为了进一步分析每种细胞类型的差异表达基因，研究使用GO富集分析比较了VLS与对照组织之间的变化。每种细胞类型在不同样本中排名前5的差异表达基因如图2A所示。在病灶组织的T细胞中，上调的差异表达基因主要与免疫调节和激活相关，并且主要富集在细胞毒性、细胞杀伤和免疫相关通路。在角质形成细胞中，角蛋白相关基因的表达增加，主要富集在中间丝组织和表皮发育通路。成纤维细胞表现出胶原相关基因的上调，差异表达基因主要富集在与胶原纤维组织、内源性抗原的抗原加工和呈递以及白细胞迁移调节相关的通路中。在黑素细胞中，上调的基因主要富集在与细胞介导的免疫以及抗原加工和呈递相关的通路。
各细胞亚群的基因表达变化
对单细胞RNA测序数据中的T细胞、角质形成细胞和黑素细胞进行亚群分析发现，特别值得注意的是，以GZMB/GZMK和GNLY/XCL1为标志物的T细胞在VLS组织中显著增加。这种增加与这些亚群中编码促炎细胞因子的基因表达水平升高相关。此外，在角质形成细胞中，AZGP1/APOD亚群中的KRT19表达被确定为VLS组织特有的角质形成细胞亚群。在黑素细胞中，CD74/IGKC亚群在VLS组织中的相对比例增加最为显著。细胞通讯分析显示，各种细胞类型之间的相互作用总体增加，其中T细胞与成纤维细胞之间的相互作用强度增加最为明显。这些结果表明T细胞及其与其他细胞类型的相互作用在这种疾病的炎症过程中起着关键作用。
脂质代谢组学提示黑素生成代谢物的改变可能与色素耗竭相关
通过靶向代谢组学分析，研究探讨了黑素细胞变化的基础。通过偏最小二乘判别分析（PLS-DA）将VLS样本与正常对照样本区分开来。共鉴定出44种代谢物在对照和VLS样本中的丰度存在显著差异。差异表达最显著的代谢物显示在热图中。显著改变的代谢物类别以饼图呈现。富集分析显示，VLS组织中的代谢变化与三羧酸循环或氨基酸代谢相关。特别值得注意的是，观察到VLS样本中与黑色素相关的代谢物犬尿氨酸显著增加。
免疫荧光表型的变化
对8例VLS组织和7例对照组织进行了角蛋白5和角蛋白10染色。在所有对照样本中，K10在棘层角质形成细胞中表达，K5在基底层细胞中表达。而在所有VLS病灶组织中，K5在基底层和棘层细胞中均有表达，并且在棘层中K5和K10存在明显的共染色。此外，VLS组织中的基底层细胞失去了正常的单层结构，排列紊乱。通过对VLS和对照组织之间K5和K10共定位相对面积的t检验，发现VLS组显著增加。研究还对6例患者的VLS组织和5例对照组织进行了角蛋白14染色。结果显示，在对照组中，5个样本中有4个在基底层角质形成细胞中表达K14，而一个样本在基底层和棘层细胞中均有表达。而对于6例VLS组织，K14在基底层和棘层细胞中均有表达。
研究评估了9例VLS组织和6例对照组织中CD8和GZMB的免疫荧光染色，以及3例VLS组织和3例对照组织中IFN-γ和TNF-α的免疫荧光染色。对阳性信号相对面积进行t检验，结果显示与对照组相比，VLS组织中CD8、GZMB、IFN-γ和TNF-α均显著增加。这些发现凸显了VLS中炎症反应的增强，表明这些免疫标志物在该疾病的病理过程中发挥着积极作用。
讨论
既往研究表明VLS是一种与Th1反应相关的自身免疫性疾病。然而，早期的实验使用同种异体组织进行基因表达谱分析，这引入了遗传背景干扰，并且仅限于检测与现有基因组序列相对应的转录本。本研究单细胞测序的结果显示皮肤组成细胞的比例减少，而T细胞的相对丰度显著增加。观察到的T细胞增加与先前对VLS大块样本进行的微阵列分析和RNA测序分析结果一致。这些变化也与VLS的病理变化相符，VLS可影响整个皮肤结构，包括表皮萎缩、基底细胞液化变性、排列紊乱、真皮胶原均质化以及带状炎性细胞浸润。病灶组织T细胞中上调的差异表达基因主要与细胞毒性、细胞杀伤和免疫相关通路相关。这表明T细胞在VLS的发病机制和进展中起着重要作用，可能通过炎症反应对皮肤组成细胞发挥细胞毒性作用。
在病灶组织中，上调的T细胞亚群表现出GNLY的高表达，该基因编码颗粒溶素。颗粒溶素主要在活化的细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞中表达，作为一种具有细胞毒性的免疫效应分子。先前的研究表明，颗粒溶素表达水平与细胞免疫状态相关。由细胞毒性T淋巴细胞分泌的颗粒溶素通过诱导细胞凋亡发挥重要的抗癌作用。肿瘤浸润效应记忆T细胞中低的颗粒溶素表达与结直肠癌的转移和不良预后相关。研究表明，颗粒溶素是Stevens-Johnson综合征/中毒性表皮坏死松解症发病机制中角质形成细胞凋亡的重要诱导剂，并参与其他皮肤疾病的发展，包括银屑病和扁平苔藓。
GZMK和GZMB是颗粒酶家族的成员，具有细胞毒性功能。颗粒酶B的作用机制明确。它在穿孔素的协助下进入靶细胞发挥细胞毒性作用。干扰素-γ是一种与Th1免疫反应特异性相关的促炎细胞因子，它通过与靶细胞上的受体结合来介导细胞毒性。热休克蛋白可以与Toll样受体相互作用，激活抗原呈递细胞、T细胞和B细胞，从而调节免疫功能。它们也可作为免疫反应中的靶点，并参与自身免疫性疾病的发病机制。综上所述，VLS组中CD8+T细胞内细胞毒性相关基因表达的上调提示其与Th1免疫反应相关。活化的细胞毒性T细胞促进炎症反应，并导致多种皮肤细胞类型的损伤。需要进一步的研究来阐明这些细胞毒性T细胞的具体靶点。基于这些发现，T细胞可被视为VLS发病机制和进展中的关键免疫细胞。
在生理条件下，表皮角质形成细胞从基底层有序地迁移，经过棘层到达角质层。通常以稳定表达角蛋白K5和K14为特征的基底层角质形成细胞，产生主要表达K10的棘层细胞。在病理条件下，基底层角质形成细胞的屏障功能受损，导致角蛋白表达失调以及基底层和棘层角蛋白的共表达。
值得注意的是，患者VLS2的角质形成细胞数量显著减少，并且缺乏KRT19阳性细胞。这与外阴萎缩的临床表现相关，导致捕获的角质形成细胞较少。此外，该患者是唯一没有临床症状且没有外阴搔抓行为的患者，这避免了外阴表皮的反应性增厚，也可能解释了观察到的细胞数量减少。
结果表明，VLS组织中与成纤维细胞相关的差异表达基因主要富集在与胶原纤维组织相关的通路中。与对照组相比，VLS组织中的成纤维细胞COL1A1和COL3A1的表达上调超过3倍，COL5A1的表达增加超过2倍。这表明在VLS发生炎症和损伤后，成纤维细胞可能通过上调胶原蛋白合成来增强组织修复。
犬尿氨酸相关代谢物可防止黑色素聚合物的形成。犬尿氨酸的丰度可能受到包括肿瘤坏死因子在内的炎性细胞因子的强烈调控。在VLS样本的批量RNA测序数据中观察到TNF mRNA的增加。需要进一步的研究来了解免疫代谢紊乱对黑素细胞存活的影响。
单细胞RNA测序分析的结果也证实，色素沉着的损害是由黑素细胞数量减少引起的，而不是色素产生减少。由于在单细胞RNA测序图谱中完全未检测到黑素细胞，本研究探讨了黑素细胞减少的原因。需要对早期VLS样本进行单细胞RNA测序分析，以了解色素沉着变化的生化细节。
据研究者所知，本研究首次综合应用单细胞RNA测序结合脂质代谢组学来研究VLS的细胞和分子改变。然而，必须承认在解释研究结果时需考虑几个重要的局限性。样本量可能限制研究结果的普遍性。需要更大的队列来考虑患者间的差异，特别是考虑到VLS的慢性和多因素性质。此外，技术变异性和批次效应是实验设计中需要考虑的重要因素。尽管采用了标准化方案，但在不同测序批次中处理样本可能会引入技术混杂因素，从而影响细胞类型定量和差异表达分析。研究者采用了已建立的生物信息学方法，包括Seurat中的典型相关分析和数据整合方法，以减轻这些影响并确保跨样本的稳健细胞类型识别。尽管如此，残留的批次效应可能仍会影响对条件之间细微转录差异的解释。
学界广泛认为VLS是一种炎症性疾病。阐明VLS中免疫细胞的变化可能有助于医生和科学家开发靶向疗法。本研究中发现的VLS组织中T细胞的特异性增加，揭示了T细胞在VLS发病机制中的独特作用。针对T细胞活性的基于细胞或抗体的疗法对VLS发展的治疗效果应在临床中进行测试。VLS组织中成纤维细胞和黑素细胞的抗原加工和呈递通路中的基因显著上调。由于缺乏表面蛋白信息，研究者无法识别T细胞与其他抗原呈递细胞之间的相互作用和分子机制，或与VLS相关的特定T细胞亚群。未来研究者将使用更强大的技术专门分析这些T细胞。
结论
总之，本研究利用单细胞RNA测序揭示了VLS中细胞组成的变化。本研究提供的系统且无偏倚的发现，为理解潜在的病理机制提供了见解，并将推动VLS特异性疗法的发展。
