《Acta Biomaterialia》：Spatially controlling cardiac fibroblast-to-myofibroblast transition using Young’s modulus patterned GelMA hydrogels
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本文报道了一种利用钌/过硫酸钠（Ru/SPS）光引发系统和数字光投影装置，在明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶中实现杨氏模量空间精确图案化的新方法。该平台成功模拟了从健康（~10 kPa）到纤维化（~45 kPa）心肌组织的机械梯度，并首次在单一水凝胶构建体中实现了对心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的空间引导，为研究心脏纤维化等疾病的机械生物学机制提供了高分辨率的体外模型。
想象一下，人体内的心脏在经历了一次严重的“打击”（如心肌梗死）后，会启动自我修复程序。这个过程就像在破损处打上“补丁”，形成疤痕组织。这个“补丁”主要由一类名为成纤维细胞的“建筑工”转变而来的超级“建筑工”——肌成纤维细胞负责构建。然而，这个修复过程有时会失控，导致疤痕组织过度生长、变硬，这就是心脏纤维化。变硬的疤痕会严重影响心脏的舒张和泵血功能，最终可能导致心力衰竭。长期以来，科学家们知道组织“软硬”（即杨氏模量）的变化是驱动成纤维细胞活化、转化为肌成纤维细胞并导致纤维化进程的关键信号。但在实验室中，如何精确地模拟出体内那种从健康柔软组织到病变僵硬组织之间复杂、渐变的“软硬”环境，一直是一个巨大的挑战。大多数传统的水凝胶模型机械性质单一，无法反映这种空间异质性，限制了我们对疾病机制，特别是细胞如何感知并响应这种机械梯度而迁移、活化的深入理解。为了攻克这一难题，来自奥克兰大学的研究团队在《Acta Biomaterialia》上发表了一项创新研究，他们开发了一个高精度的“光刻”平台，能够像投影仪“打印”图像一样，在水凝胶中“绘制”出任意形状的“软硬”图案，从而在体外成功复现了心脏纤维化过程中的关键机械微环境，并首次在单一水凝胶中实现了对细胞命运的“空间编程”。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，合成了具有生物活性的明胶甲基丙烯酰（Gelatin methacryloyl, GelMA）水凝胶，并采用钌/过硫酸钠（ruthenium/sodium persulfate, Ru/SPS）这一可见光引发体系进行交联，以提升生物相容性。其次，自主搭建了一套基于数字微镜器件（digital micromirror device, DMD）的自定义光投影系统，通过编程控制投射光的灰度图案，从而在GelMA水凝胶中实现杨氏模量的空间图案化。再者，利用原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）的球形探针压痕技术，对图案化水凝胶各区域的杨氏模量进行高分辨率表征与验证。最后，将人源心室心脏成纤维细胞封装于不同图案的水凝胶中进行三维培养，并通过复杂的共聚焦显微镜三维成像、结合基于Python和scikit-image库开发的定制化细胞分割算法，对培养7天后的细胞体积、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）应力纤维形成、细胞密度及取向等关键表型参数进行定量分析。
3.1. 系统优化与杨氏模量的精细调控
研究人员首先优化了Ru/SPS光引发体系的浓度，确定了0.4 mM Ru和4 mM SPS为理想配方。通过调节光照时间或强度，他们能够在非图案化凝胶中将杨氏模量在4 kPa到46 kPa之间精确调控。特别地，他们选定0.34 mW·cm-2和6.8 mW·cm-2的光强（对应~10 kPa和~45 kPa的模量）分别模拟健康与纤维化心肌的机械环境。
3.2. 杨氏模量的空间图案化
利用自定义的DMD投影系统，研究人员成功制备了两种图案化的水凝胶。一种是二元图案，其杨氏模量可在约20微米的距离内从10 kPa陡变为45 kPa，梯度高达2.3 MPa·mm-1，空间分辨率优于以往报道。另一种是梯度图案，在3毫米的距离内实现了从10 kPa到45 kPa的近线性过渡，梯度约为10 kPa·mm-1，与生理组织中观察到的梯度（~10 kPa/mm）高度吻合。AFM测量证实，无论是凝胶顶部还是底部表面，图案化的杨氏模量分布均与设计的光强图案高度一致。
3.3. 成纤维细胞在非图案化及二元图案化水凝胶中的响应
将心脏成纤维细胞封装在模拟健康（10 kPa）和纤维化（45 kPa）的均一水凝胶中培养7天后发现，与健康环境相比，纤维化环境中的细胞体积显著增大，且形成α-SMA应力纤维的细胞比例从约24%大幅提升至约75%。在二元图案化水凝胶中，研究人员观察到了相同的趋势：位于纤维化区域的细胞体积更大、α-SMA表达更强，而健康区域的细胞则保持相对静止的表型，且在距离模量边界20微米以外的区域，这种表型差异就已截然分开，证明了该平台能够空间控制成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化。
3.4. 梯度图案化水凝胶
在更接近生理情况的梯度图案化水凝胶中，细胞行为呈现出连续且依赖模量的变化。随着杨氏模量从10 kPa向45 kPa增加，细胞的平均体积和表达α-SMA纤维的细胞比例均呈现渐进式上升。更引人注目的是，细胞密度沿着梯度方向从较软端向较硬端显著增加，而两端非梯度区域的细胞密度则无此变化，这强烈提示细胞存在趋向硬度的迁移（durotaxis）。此外，梯度区域内的细胞不再随机分布，而是将其长轴主要排列在沿梯度方向的±45度范围内，显示出明显的机械导向性排列。
研究的结论与讨论部分强调了该平台的创新性与重要意义。首先，这项研究成功开发了一个高度通用、可编程的光刻平台，能够以前所未有的空间精度（~20 μm）快速构建生理或非生理相关的复杂机械微环境，超越了传统光掩模或扩散法在分辨率和灵活性上的限制。其次，研究证实了杨氏模量梯度是调控心脏成纤维细胞行为的核心物理因素：它不仅驱动了细胞从静止表型向活化表型的转变（表现为体积增大和α-SMA纤维化），还引导了细胞的定向迁移和排列。这些发现在均一或简单二元体系中是无法获得的，凸显了模拟连续机械梯度对于理解诸如疤痕边界细胞动力学等生理过程的关键价值。该平台的潜力远不止于心脏纤维化研究，其杨氏模量可调范围宽，可轻松适配于研究神经元（偏好软基质）、肌腱细胞（偏好硬基质）、癌症转移（受机械梯度影响）等多种生物系统。最后，作者也指出了当前工作的局限，如三维成像中的自发荧光干扰、无法追踪细胞对凝胶基质的胶原重塑，以及未来需要向包含心肌细胞的共培养体系发展，以构建更完整、更具预测性的心脏疾病模型。总之，这项工作在简化的均匀模型与复杂的体内异质微环境之间架起了一座桥梁，为机械生物学研究和组织工程疾病模型的构建提供了一个强大而灵活的新工具。
