《Algal Research》：Bead milling and ultrasonication as scalable techniques for cell disruption of
Chlorella vulgaris
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微藻细胞破碎效率对比研究显示，球磨法在半连续模式下完全破碎C. vulgaris细胞壁，而超声处理仅达74-84%破碎率，且长时间处理导致蛋白质聚集和色素降解。两者均遵循一级动力学模型，冻干预处理对最终破碎度无显著影响，但需注意工艺参数优化。
汤姆·伯纳茨（Tom Bernaerts）| 萨拉·古森斯（Sarah Goossens）| 埃尔温·斯威宁（Erwin Swinnen）| 奥黛丽·德库伊珀（Audrey De Cuyper）| 弗洛里斯·斯科特斯（Floris Schoeters）| 萨宾·范米尔特（Sabine Van Miert）
比利时海尔市托马斯莫尔应用科学大学（Thomas More University of Applied Sciences）可持续生物质与化学专家中心（Centre of Expertise Sustainable Biomass and Chemistry）
摘要
本研究探讨了珠磨法和超声波处理对C. vulgaris悬浮液中的细胞破坏及可溶性化合物释放效果。珠磨法和超声波处理均以半连续模式进行，分别使用新鲜藻泥和冻干微藻制备的悬浮液，以研究起始材料的影响。珠磨法实现了细胞完全破坏，而超声波处理仅破坏了74–84%的C. vulgaris细胞（通过细胞计数确定）。两种方法下的细胞破坏过程均遵循一级动力学规律。两种技术在破坏速率上无显著差异，仅在最终破坏程度上存在差异。可溶性碳水化合物、蛋白质和色素的释放过程与细胞破坏过程具有相同动力学特征。尽管采取了预防性冷却措施，但在超声波处理时间超过45分钟时，仍观察到蛋白质聚集和色素降解现象，而珠磨法未出现此类问题。此外，起始材料（新鲜藻泥与冻干粉末）的差异对初始破坏程度影响较小，但对最终破坏程度无显著影响。对于像C. vulgaris这样具有坚韧细胞壁的微藻，珠磨法因更高的破坏效率而成为更优选的技术。
引言
几十年来，微藻被研究作为多种应用的有前景的来源，包括食品和饲料、制药、水产养殖、废水处理以及植物生物刺激剂[1]、[2]、[3]。在大多数应用中，需要释放细胞内代谢物。许多目标成分实际上位于细胞内部，但由于微藻细胞壁结构复杂且通常较为坚硬，有效回收这些化合物仍具有挑战性。这不仅适用于高价值化合物的提取，也适用于需要利用整个生物质的应用（例如提高食品中的营养素生物利用率[4]）。因此，有效的细胞破坏过程对于释放微藻生物质的全部潜力至关重要。
不同微藻种类的细胞壁硬度和组成差异很大[5]、[6]、[7]。某些种类（如）缺乏坚硬的细胞壁，易于裂解；而许多微藻则具有多层坚硬的细胞壁，形成难以穿透的结构屏障。例如，具有工业前景的微藻如、和的细胞壁由纤维素、类孢粉质聚合物和/或藻酸盐等刚性生物聚合物构成[7]、[8]、[9]、[10]。根据最终产品和提取方法的不同，可能需要完全或部分破坏细胞以有效释放细胞内代谢物。对于热敏感代谢物，可能需要采用更温和的方法以保持产品完整性。因此，细胞破坏不仅涉及破坏细胞壁，还需根据具体应用和后续加工策略优化相关过程[5]、[8]。
近年来，多种微藻细胞破坏技术得到了研究，其中珠磨法、高压均质化和超声波处理对于具有坚硬细胞壁的微藻（如C. vulgaris）最具潜力[8]、[11]。尽管已有大量相关研究，但由于缺乏不同处理方法的破坏动力学比较研究，选择合适的技术仍具有挑战性。然而，这些信息对于评估破坏效率以及产品质量和能源效率至关重要。此外，也有研究针对重新悬浮的冻干微藻进行了破坏实验[12]、[13]、[14]。虽然有研究表明冻干预处理可能影响破坏效率[15]，但尚未通过破坏动力学进行机制分析。
在本研究中，将比较两种技术：珠磨法和超声波处理。珠磨法利用小珠子（通常由玻璃、陶瓷或氧化锆制成）高速搅拌微藻悬浮液，珠子与细胞碰撞产生的冲击力和剪切力会破坏细胞壁[8]、[11]。虽然珠磨法已被证明对微藻破坏有效，但需优化操作参数（如珠子大小、搅拌速度和停留时间[16]、[17]、[18]、[19]）。该过程能耗较高，冷却对于防止微藻悬浮液过热、保护热敏感化合物至关重要[11]。超声波处理利用高频声波（通常20–40 kHz）在液体介质中产生空化现象。当超声波能量作用于微藻悬浮液时，会形成并剧烈破裂的气泡，产生局部剪切力和冲击波，从而破坏细胞壁[5]、[8]。实验室规模的研究表明超声波处理在批次模式下对微藻破坏效果良好[20]、[21]，但关于大规模半连续超声波处理的效果知之甚少。据报道，大规模应用时可能因能量效率低下和穿透力不足而降低破坏效率。此外，长时间处理可能导致敏感分子降解，但由于现有研究缺乏机制分析，这一问题常被忽视[5]、[8]。本研究将在半连续模式下大规模应用这两种技术，以填补相关研究空白。
为了有效评估和比较破坏方法，需理解细胞破坏是一个多阶段的连续过程。正如Spiden等人所描述的[22]、[23]，微藻细胞破坏包括：(i) 细胞壁的初始物理损伤，(ii) 膜通透性和细胞质泄漏，(iii) 大规模细胞裂解，最终导致(iv) 细胞完全破碎。这些阶段可能按顺序或同时发生，取决于所用的破坏方法和能量输入。需要注意的是，各种分析方法都有其局限性，只能识别破坏过程的特定阶段。因此，准确评估细胞破坏通常需要结合多种分析技术[14]、[23]。显微镜分析可用于观察细胞结构完整性，细胞计数可用于定量评估破坏程度[23]。代谢物释放测量（如蛋白质释放或总代谢物吸收的紫外吸收测定）有助于量化目标化合物，但这些间接方法往往高估或低估了微藻的破坏程度[23]。细胞内释放化合物的数据可提供关于破坏过程对产品质量影响的额外信息，例如热敏感化合物的温度影响[20]、[23]。此外，颗粒大小分布测量可用于量化群体层面的破坏情况，但当细胞或细胞碎片聚集时，该方法会受到限制[14]、[23]。
选择C. vulgaris作为研究对象，是因为其具有较高的工业价值，并且已知具有坚硬的多层细胞壁[7]、[24]。属于绿藻门的属微藻具有最复杂的细胞壁组成，其细胞壁可能包含(i)富含葡糖胺的成分，(ii)以甘露糖和葡萄糖为主要成分的细胞壁，或(iii)富含半乳糖、葡萄糖和甘露糖的细胞壁[6]、[7]、[25]。第一种类型的细胞壁硬度归因于几丁质类多糖；多数研究者认为C. vulgaris的细胞壁硬度主要由纤维素微纤维贡献[6]、[20]、[26]、[27]。细胞壁硬度还受生长阶段影响[28]，尽管有研究表明细胞壁厚度受培养条件影响，但并不一定影响其机械破坏敏感性[29]。
本研究的目的是比较珠磨法和超声波处理对C. vulgaris细胞的破坏效果。两种破坏方法均在大规模半连续模式下进行，以更贴近实际工业应用。为了解破坏动力学，分析了不同处理时间的样本，并建立了动力学模型。使用多种分析方法（包括显微镜观察和细胞计数）量化细胞破坏程度以及可溶性蛋白质、碳水化合物和色素的释放情况。同时，通过比较新鲜收获的微藻与冻干（并重新悬浮）微藻的破坏效果，研究了干燥步骤对破坏动力学的影响。因此，本研究为珠磨法和超声波处理这两种可扩展的微藻细胞破坏技术提供了重要见解。
实验部分
培养
C. vulgaris（SAG 211–12）购自德国哥廷根大学（University of G?ttingen）的SAG实验室（实验藻类学与藻类培养收藏部门）。种子培养物在250 mL锥形瓶中，置于轨道摇床（90 rpm）上，在温度控制室（22°C）和光照强度（70 μmol/m2·s，冷白光）条件下培养，光照周期为16小时光照/8小时黑暗。使用的无菌淡水培养基（121°C高压灭菌20分钟）配方如下：
利用显微镜分析量化细胞破坏程度
对新鲜收获的藻泥或冻干粉末制备的C. vulgaris悬浮液进行了不同时间的珠磨法和超声波处理。处理过程中使用光学显微镜观察微藻细胞，图1展示了新鲜C. vulgaris悬浮液的显微图像。冻干C. vulgaris悬浮液也表现出类似的趋势（图像未展示）。在任何细胞破坏处理之前：
结论
本研究探讨了珠磨法和超声波处理作为破坏坚硬细胞壁微藻（如C. vulgaris）的可行技术。两种方法均以半连续模式进行，同时研究了冻干预处理的影响。珠磨法实现了细胞完全破坏，而超声波处理仅破坏了74–84%的细胞。这一结果与文献一致，证实了...
CRediT作者贡献声明
汤姆·伯纳茨（Tom Bernaerts）：撰写 – 审稿与编辑，撰写初稿，数据可视化，项目管理，方法学设计，实验设计，数据分析，概念化。萨拉·古森斯（Sarah Goossens）：方法学设计，实验设计，数据分析。埃尔温·斯威宁（Erwin Swinnen）：方法学设计，实验设计，数据分析。奥黛丽·德库伊珀（Audrey De Cuyper）：方法学设计，实验设计。弗洛里斯·斯科特斯（Floris Schoeters）：撰写 – 审稿与编辑，方法学设计，实验设计。萨宾·范米尔特（Sabine Van Miert）：撰写 – 审稿与编辑，资源协调。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了佛兰德斯研究基金会（FWO）的资助（资助编号：S001622N）。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿准备。
