《Algal Research》：Synthesis-dependent effects of silver nanoparticles on the green freshwater alga
Chlorella vulgaris
编辑推荐：
银纳米颗粒（AgNPs）合成路线影响绿藻光生理及氧化还原平衡：比较生物合成（Agbio）、化学还原（Agchem）和激光处理（Agphys）AgNPs对模型生物Chlorella vulgaris的效应，发现Agbio显著抑制红叶绿素荧光（680 nm），并改变NAD(P)H荧光寿命；Agchem和Agphys主要影响代谢标记（如NAD(P)H荧光）和叶绿素寿命动力学。合成方法通过改变AgNPs表面化学特性调控其生物效应，证实合成路线是藻类响应的关键因素。
马塞克·霍尔瓦托娃·阿尔兹贝塔（Marcek Chorvatova Alzbeta）、乌赫雷克·马丁（Uherek Martin）、马特亚西克·安东（Mateasik Anton）、布鲁恩科·雅罗斯拉夫（Bruncko Jaroslav）、马图西科娃·伊尔迪科（Matusikova Ildiko）、塞德拉克科娃-卡杜科娃·雅娜（Sedlakova-Kadukova Jana）
斯洛伐克科学技术信息中心国际激光中心生物光子学系，地址：Ilkovicova 3，84104，布拉迪斯拉发，斯洛伐克
摘要
通过不同途径合成的银纳米颗粒（AgNPs）在表面化学性质上存在差异，这些差异可能会影响藻类的光生理学和氧化还原平衡。本研究将生物方法制备的AgNPs（Agbio）与化学还原的柠檬酸包覆AgNPs（Agchem）以及激光烧蚀的AgNPs（Agphys）对模式生物普通小球藻（Chlorella vulgaris的影响进行了比较，以了解纳米颗粒在水生环境中的效应。通过紫外-可见光吸收光谱、光谱分辨的激光扫描共聚焦显微镜观察叶绿素荧光、叶绿素荧光寿命成像（FLIM）、黄素自荧光成像以及NAD(P)H的时间相关单光子计数（TCSPC）技术来分析这些效应，同时扫描电子显微镜提供了形态学背景信息。Agphys、Agbio和Agchem的吸收峰值分别出现在407 nm、410 nm和412 nm。Agbio对680 nm处的叶绿素荧光抑制作用最强。FLIM实验显示，在445 nm脉冲激光激发下，7天内黄素荧光强度有特定变化。在483至632 nm范围内监测黄素荧光时，Agchem/Agphys的黄素荧光强度立即升高，而Agbio仅在第七天才显示出显著变化。通过TCSPC技术在420–680 nm范围内（405 nm激发）记录的NAD(P)H荧光寿命显示，第一天NAD(P)H光子计数急剧下降，Tau1持续增加；Agbio的Tau2持续升高，Agphys的Tau2短暂增加，而Agchem没有持续升高。数据支持一种两阶段的氧化还原响应机制——初期补偿后是依赖颗粒类型的耗竭或重新平衡，并表明在我们的实验条件下，Agbio的光毒性最强，其次是Agchem，Agphys次之。研究结果表明，合成途径是决定藻类反应的主要因素。
引言
目前，由于纳米技术在应对全球紧迫挑战方面的多功能潜力，各个领域的研究越来越关注这一领域。纳米材料具有独特的性质，可以提高效率、增强适用性，并支持环境和经济的可持续性[1]。各种纳米颗粒（NPs）在商业产品和工业过程中的应用已经大幅扩展，预计其使用将继续增长，包括银纳米颗粒（Ag NPs）。目前已有大量文献讨论了AgNPs的性质[2]、潜在的作用机制[3]以及关键的影响因素和毒性[4]。然而，关于NPs的应用仍存在一些知识空白，需要进一步研究以评估其基于不同生产途径的分布、积累和对生物系统的长期影响。NPs对非目标生物（包括土壤和水生微生物）的环境和健康影响仍大部分未得到解释[5]。
最初认为纳米颗粒的大小和形状是决定其毒性的主要因素[6]。不同类型的纳米颗粒大小被证明会影响细胞吸收[7]和生物活性[4]、[8]。然而，后续研究表明，纳米颗粒表面根据其生产途径或暴露于生物环境后形成的“冠状层”对其生物活性有显著影响[9]、[10]。这种复杂性突显了理解不同合成方法如何影响纳米颗粒在各种生态系统成分中的性质和行为的重要性。
传统的纳米颗粒合成方法主要基于化学或物理手段，存在多个局限性。最关键的问题包括稳定性低、能耗高，以及化学方法需要使用有毒化学物质并产生有害废物。此外，生物方法的生物相容性通常较低[11]、[12]。相比之下，生物方法在过去二十年受到了越来越多的关注。多项研究证实，不同的生物体、其提取物甚至废弃的培养基都可以用于纳米颗粒的生产[13]、[14]、[15]。生物方法的最大优势在于环境可持续性和合成方法的简化；然而，这种生产途径也存在局限性，如形状和大小的不稳定性、放大困难的问题，以及由于蛋白质或多糖等包覆剂的降解导致的长期稳定性问题[16]。
鉴于生物体和生物活性分子的多样性，它们在纳米颗粒生产中的应用潜力巨大，这从不断增多的研究论文中可以得到证明。然而，生物生产途径与所生产纳米颗粒特性之间的关系仍需进一步探索。只有少数研究试图直接了解与纳米颗粒合成方法相关的差异。例如，[5]研究了使用植物提取物制备的纳米颗粒的特定生物活性，如抗癌、抗菌和抗氧化特性，而[17]比较了化学方法和生物方法制备的银纳米颗粒的抗菌活性。
生物方法的最新进展，包括我们之前使用Parachlorella kessleri（P. kessleri）的水提取物制备生物纳米颗粒的工作[18]、[19]、[20]，展示了它们的巨大潜力，这不仅归功于其环境可持续的合成方法，还因为所生产纳米颗粒的独特性质。
本研究的目的是应用先进的生物光子学方法，比较不同生产方式制备的AgNPs对模式绿藻普通小球藻（Chlorella vulgaris内源性荧光和细胞氧化还原平衡的影响。具体来说，通过共聚焦显微镜和时间分辨荧光技术研究了生物方法制备的AgNPs（Agbio）、化学还原的柠檬酸包覆AgNPs（Agchem）以及激光烧蚀的多分散AgNPs（Agphys）的作用，以阐明传统批量实验无法揭示的合成特异性响应。
部分内容
生物方法
生物合成的AgNPs是使用P. kessleri生物质的水提取物制备的，如先前所述[18]、[19]、[20]。简要来说，1克干藻类生物质在200毫升蒸馏水中煮沸20分钟。提取物经过0.22微米过滤后，加入AgNO3溶液，使最终银浓度达到100毫克/升。生物制备的AgNP的完整合成方案和物理化学表征（紫外-可见光光谱、傅里叶变换红外光谱、透射电子显微镜、能谱仪）已在先前的研究中完成
结果
我们的研究旨在比较不同生产途径制备的AgNPs对模式水生生物——微观绿藻C. vulgaris的生物学效应。采用了三种合成方法：一种是使用P. kessleri生物质的生物方法，另一种是使用柠檬酸钠的化学方法，还有一种是使用金属盘激光烧蚀的物理方法。我们采用了一套综合技术来获得全面的信息——包括光学、功能、代谢和超微结构方面的数据
讨论
研究结果表明，AgNPs对C. vulgaris的作用机制存在差异，这取决于它们的生产来源。生物方法制备的Agbio主要影响叶绿素，导致叶绿素荧光强度降低，并伴随荧光寿命的缩短。而化学和物理方法制备的Agchem和Agphys则主要影响藻类的代谢过程，这通过它们对黄素和NAD(P)H的影响得到证实
结论
通过活藻P. kessleri提取物生物法制备的AgNPs与化学法（使用柠檬酸钠）和物理法（使用激光烧蚀金属盘）制备的AgNPs进行了比较。使用C. vulgaris作为模式生物，研究了这些AgNPs对水生生态系统中生物体的生物学效应。我们的观察表明，生物法制备的AgNPs对藻类内源性叶绿素荧光有显著影响。
CRediT作者贡献声明
马塞克·霍尔瓦托娃·阿尔兹贝塔（Marcek Chorvatova Alzbeta）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、研究、概念化。乌赫雷克·马丁（Uherek Martin）：研究、数据管理。马特亚西克·安东（Mateasik Anton）：形式分析、数据管理。布鲁恩科·雅罗斯拉夫（Bruncko Jaroslav）：研究。马图西科娃·伊尔迪科（Matusikova Ildiko）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿。塞德拉克科娃-卡杜科娃·雅娜（Sedlakova-Kadukova Jana）：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、研究、概念化。伦理批准
由于本研究的实验对象为不受监管的无脊椎动物，因此无需获得研究伦理委员会的批准。本研究未涉及患者。部分英语编辑工作（语法和句法）由ChatGPT（OpenAI，旧金山，美国）协助完成。此外，还使用了Grammarly工具来确保语言的清晰性和一致性。
资助
本研究由欧盟NextGenerationEU通过斯洛伐克恢复与韧性计划下的ENVIROBIOM No 09I03–03-V04–00689项目以及斯洛伐克共和国教育、科学、研究与体育部的资助机构根据合同VEGA 1/0785/26提供资金支持。
备注：本工作是最近完成的项目LASERLAB-EUROPE（欧盟地平线2020研究与创新计划，项目编号871124，A.C.）的延续。
未引用参考文献
[82]、[83]、[84]、[85]、[86]、[87]、[88]
利益冲突声明
除已声明的资助和隶属关系外，不存在其他利益冲突。
致谢
作者感谢FPV UCM的R. Hancinsky博士和P. Hlubina工程师在C. vulgaris培养方面提供的帮助。
