《Analytica Chimica Acta》：Extracellular vesicles released in vitro from a Parkinson's Disease-like model: a combined biochemical and spectroscopic approach as proof of concept for the diagnosis of neurodegenerative diseases
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选择性检测帕金森病相关外泌体的双方法学研究，结合生物化学检测和傅里叶变换红外光谱分析，证实外泌体携带的α-突触核蛋白聚合体可通过点印迹法识别及光谱特征区分，为液体活检提供新思路。
萨布丽娜·罗曼诺（Sabrina Romanò）| 大卫·贝塞里尔·罗德里格斯（David Becerril Rodriguez）| 阿曼达·斯帕希乌（Amanda Spahiu）| 法比奥·多梅尼奇（Fabio Domenici）| 克劳迪娅·马祖卡（Claudia Mazzuca）| 安东尼奥·克里森蒂（Antonio Cricenti）| 埃娃·克里斯蒂娜·克拉斯诺夫斯卡（Ewa Krystyna Krasnowska）| 安娜卢西亚·塞拉菲诺（Annalucia Serafino）
意大利国家研究委员会（CNR）转化药理学研究所，罗马00133
摘要
背景
细胞外囊泡（EVs）是稳定的分子信号载体，能够穿越血脑屏障，因此有望成为中枢神经系统疾病的无创生物标志物。
虽然它们的诊断潜力已经得到证实，并在许多脑肿瘤的临床试验中得到应用，但在帕金森病（PD）等神经退行性疾病中的应用仍处于探索阶段。尽管研究人员已经证明EVs参与了α-突触核蛋白的细胞间扩散（这是PD病理的一个特征），但由于缺乏标准化和选择性的EV分离和分析方案，EVs作为疾病生物标志物的临床应用仍然受到限制。
结果
在这里，我们提出了一种结合生化和光谱技术的双重方法来选择性检测与PD相关的EVs。作为多巴胺能神经元的细胞模型，我们使用了经过视黄酸诱导分化的人类神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y，并对其施加6-羟基多巴胺（6-OHDA）以模拟类似PD的神经退行性变化。Western blot分析显示，暴露于这种神经毒素的SH-SY5Y细胞中含有高分子量的α-突触核蛋白，这些蛋白具有高度毒性，并且也在EVs中被检测到。此外，一种对聚集的α-突触核蛋白具有选择性敏感性的点印迹（dot-blot）实验表明，这些蛋白位于新鲜、完整的PD相关EVs的膜表面。傅里叶变换红外光谱（FTIR）还识别出可能与病理状态相关的生化特征，从而区分出携带聚集α-突触核蛋白的EVs。
意义
通过结合这些仅需少量样本的生化和光谱方法，我们能够选择性地识别出携带聚集、有毒形式的α-突触核蛋白的囊泡。我们的发现突显了这些生物标志物在诊断和无创检测方面的潜力，支持其在神经退行性疾病液体活检中的潜在应用。
引言
帕金森病（PD）是一种逐渐发展的疾病，通常始于不易察觉的变化，如动作迟缓、轻微震颤和僵硬，这些症状常被误认为是衰老的表现。然而，其背后是一个由于黑质致密部（substantia nigra compacta）中多巴胺能神经元逐渐丧失而引起的进行性神经退行过程，该区域对运动控制至关重要[2]、[3]。随着疾病的发展，运动症状变得越来越严重，同时还会出现抑郁、认知衰退和自主功能障碍等非运动症状，进一步影响生活质量[4]。尽管经过数十年的研究，PD在早期阶段的诊断仍然是一个重大的临床挑战[5]。目前没有可靠的生前检测方法，早期症状往往不具有特异性。目前的诊断主要基于临床评估，许多病例的最终确认仍需通过尸检[6]、[7]、[8]。等到运动症状出现时，神经元已经遭受了实质性和不可逆的损伤[9]、[10]，因此早期诊断至关重要但难以实现。这凸显了迫切需要能够早期识别疾病的敏感和特异性生物标志物，以便尽早干预并开发更有效的疾病修饰疗法[5]、[11]。
神经退行性疾病（如PD）的一个特征是蛋白质（如α-突触核蛋白）的错误折叠和聚集[12]，这会导致细胞内包涵体的形成，干扰神经元功能，尤其是在突触前末端以及其他亚细胞区室[13]。PD及相关突触核蛋白病以大脑组织中富含α-突触核蛋白的包涵体（称为路易小体）的积累为特征，这些包涵体促进了神经退行性变[14]、[15]。因此，在血液、尿液和脑脊液（CSF）等生物流体中检测这种病理蛋白可以提高诊断能力[16]、[17]。近年来，外周生物标志物受到了关注，脑脊液分析通过测量α-突触核蛋白及相关蛋白提供了有价值的信息，但腰椎穿刺的侵入性以及生物标志物水平的变异性限制了其常规临床应用[18]。虽然已经确定了血液中的生物标志物候选物（如α-突触核蛋白、DJ-1和LRRK2[19]），但由于它们的特异性较低——尤其是α-突触核蛋白和DJ-1在健康个体中也存在——这限制了它们的诊断价值[5]。此外，这些标志物在体液中的浓度极低，估计不到总血蛋白的十亿分之一和总脑脊液蛋白的百万分之一[20]，使得技术上难以检测。在这种情况下，开发敏感有效的生物标志物的有效策略是关注除可溶性蛋白之外的体液成分，例如细胞外囊泡（EVs）[21]。
EVs是一类异质性的细胞来源膜囊泡，分泌到细胞外空间。它们根据大小和生物发生方式可分为小囊泡（sEVs，包括外泌体（exosomes）和微囊泡（microvesicles）以及大囊泡（如凋亡小体（apoptotic bodies）[23]。
小囊泡（sEVs）以其直径（约30–200纳米）和特定的生物发生标志物（如Alix、TSG101、HSC70、HSP90β和四跨膜蛋白CD81、CD9、CD63）来定义[24]。在中枢神经系统（CNS）中，EVs参与细胞间通讯，并参与生理和病理过程[25]。特别是神经元和胶质细胞的EVs可以通过跨细胞转运（transcytosis）穿越血脑屏障（BBB），从而进入全身循环并进入外周流体。
越来越多的证据表明，病理性的α-突触核蛋白是通过sEVs的脂质双层进行转运的[27]、[28]。在血液[29]、[30]、血清[31]和唾液[32]等多种生物流体中持续检测到来自EVs的α-突触核蛋白。此外，人们普遍认为EV介导的转运在促进PD病理在整个CNS中的传播中起着重要作用[33]。
这些结果使得EVs成为无创检测脑源性病理蛋白的有希望的生物标志物[34]，有可能克服PD生物标志物识别的一些主要挑战[35]。
尽管EVs具有潜力，但基于EV的诊断方法的临床应用仍受到缺乏标准化分离方案以及需要快速、选择性和临床适用的分析工具的限制。在这方面，无标记技术，特别是中红外范围内的傅里叶变换红外光谱（FT-IR），显示出快速和非破坏性化学分析外泌体的潜力[36]。当与机器学习结合使用时，FT-IR可以区分与疾病相关的光谱模式，这一点在临床[37]和体外研究[38]、[39]中得到了验证。然而，其有限的分子特异性需要通过补充的生化验证来弥补。为了克服这一限制而不采用可能引起样本污染和EV丢失的囊泡裂解方案，我们提出了一种专门设计用于增强EV群体分析的双重分析策略。
通过结合FT-IR光谱和靶向生化检测，我们的方法可以同时实现全面的分子分析和与PD病理相关的囊泡亚型的选择性识别。
实验部分
体外模型和诱导类似PD的神经退行性变化的治疗
人类神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y来自美国类型培养物收藏中心（ATCC）。SH-SY5Y细胞在Eagle’s Minimum Essential Medium（α-MEM，Gibco，Thermo Fisher Scientific Inc，美国）中以1:1的比例与HAM’s F12（Euroclone，Pero MI）混合培养，并添加了10%的热灭活胎牛血清（dFBS，产品编号FBS-ED-12B，Capricorn Scientific，Ebsdorfergrund）、2 mM的L-谷氨酰胺、100 IU/ml的青霉素和100 μg/ml的链霉素
类PD的细胞模型
为了获得尽可能接近人类情况的体外模型，我们将SH-SY5Y细胞分化为之前由我们团队描述和表征的成熟多巴胺能神经元表型（SHSY5Ydiff[41]、[42]、[48]、[49]。如M&M部分所述，为了模拟PD的神经退行性特征，SHSY5Ydiff细胞被暴露于6-OHDA的神经毒性损伤，并在18小时后进行分析。
图1显示了形态（图1a、b）和α-突触核蛋白的比较分析
结论
在本研究中，我们证明了FT-IR光谱与我们在协议中开发和优化的选择性点印迹检测方法的结合，能够特异性地检测小细胞外囊泡中的疾病相关生物标志物。这种双重方法所需的样本量极少，可以从生化和结构两个角度进行全面分子表征。我们的数据揭示了sEVs中存在有毒构象形式的α-突触核蛋白
CRediT作者贡献声明
法比奥·多梅尼奇（Fabio Domenici）：资源提供、可视化、撰写——审阅与编辑。克劳迪娅·马祖卡（Claudia Mazzuca）：资源提供、软件使用、可视化、撰写——审阅与编辑。安东尼奥·克里森蒂（Antonio Cricenti）：方法学设计、资源提供、可视化、撰写——审阅与编辑。埃娃·克里斯蒂娜·克拉斯诺夫斯卡（Ewa Krystyna Krasnowska）：概念构思、数据管理、正式分析、研究实施、方法学设计、项目监督、验证、可视化、初稿撰写——审阅与编辑。安娜卢西亚·塞拉菲诺（Annalucia Serafino）：资金获取
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了欧盟下一代EU计划“罗马科技园—创新生态系统”、Fondazione Intesa Sanpaolo “慈善基金”项目B/2023/0162以及国家研究委员会项目DSB的支持。
