智能微流控技术：一种集成深度学习的高精度卵母细胞膜通透性表征平台，应用于低温生物学研究

《Analytica Chimica Acta》：Intelligent Microfluidics: A Deep Learning-Integrated Platform for High-Accuracy Oocyte Membrane Permeability Characterization in Cryobiology

卵子膜渗透性动态分析：本研究开发CryoSIM集成微流控与AI技术平台，通过Y型/Zigzag微通道及抛物线阵列实现温和细胞捕获，配合被动温控系统（4-37℃）和MLSNet高精度图像分割（98.7%像素级准确），结合双参数与Kedem-Katchalsky模型自动计算水渗透率（Lp）和CPA渗透率（Ps）。该平台将分析效率提升90%以上（<5分钟/卵子，8细胞并行），变异系数降至3%以下，为规模化优化冷冻保存方案提供新工具。

　　

Kashan Memon|Bing Zhang|Muhammad Azam Fareed|Lingxiao Shen|Zhicheng Liu|Gang Zhao

中国科学技术大学电子工程与信息科学系，安徽省合肥市

摘要

背景

卵母细胞的冷冻保存技术仍受到限制，主要是因为水和冷冻保护剂（CPA）跨细胞膜传输的效率低下，这主要是由于缺乏能够量化关键渗透参数（如水力传导性（Lp）和CPA渗透性（Ps）的自动化、高通量工具。准确、可重复地测量这些参数对于优化冷冻保存方案至关重要，但目前的方法主要依赖于手动分析，导致通量低且结果不稳定。本研究旨在解决这一关键问题，提出一个可扩展的分析框架，以稳健和系统的方式表征膜传输现象。

结果

我们开发了CryoSIM，这是一个集成了微流控技术和人工智能的平台，用于自动化、并行量化卵母细胞膜渗透性。该微流控芯片采用Y形和之字形灌注通道以及抛物线形微柱阵列来建立稳定的CPA梯度，同时将流体动力剪切降至最低。深度学习模型（MLSNet）实现了98.7%的像素级卵母细胞分割精度，能够实时分析多个细胞。基于Python的定制界面实现了双参数模型和Kedem–Katchalsky传输模型，以计算不同CPA浓度和温度条件（4–37°C）下的Lp和Ps。与手动方法相比，CryoSIM的分析通量提高了90%以上，并且在生物重复实验和实验组之间表现出一致且可重复的性能。

意义

CryoSIM提供了一个统一的高通量分析工作流程，结合了微流控技术、深度学习和传输建模，能够精确表征细胞膜渗透性。这一平台在冷冻保存分析领域取得了重大进展，为生物物理传输研究、生育力保存研究和生物分析方法开发提供了广泛适用的工具。

引言

冷冻保存是细胞生物学、生物技术和生殖医学中的关键技术，可以实现活细胞和组织的长期存储，应用于生育力保存、器官移植和再生医学等领域1, 2, 3, 4, 5。尽管应用广泛，但卵母细胞的冷冻保存成功率仍然较低6, 7, 8。由于卵母细胞体积较大且表面积与体积比低，在冷冻过程中它们特别容易受到渗透压冲击和细胞内冰晶形成的影响，从而导致冷冻损伤、膜破裂和细胞活力丧失9, 10。因此，了解水和CPA跨卵母细胞膜的传输动态对于提高冷冻保存效果至关重要。传统的冷冻保存方法（如缓慢冷冻和玻璃化）依赖于乙二醇（EG）和丙二醇（PG）等CPA来减轻冰晶形成和渗透压应力11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18。这些方法需要精确控制冷却速率、CPA浓度以及添加/去除CPA的时机以避免冷冻损伤。然而，它们并未完全解决水和CPA跨膜传输的复杂动态问题，尤其是膜渗透性的变化以及温度依赖性的渗透性变化，这些因素可能严重影响冷冻保存的成功率。

近年来，微流控技术作为一种在受控环境中研究细胞膜渗透性的有效工具而出现，与传统方法相比，其变异性较低11, 19, 20。这些系统可以精确控制流体动力学和CPA梯度，但大多数用于冷冻保存研究的微流控平台缺乏高通量能力，也没有集成自动化图像分析功能。此外，现有系统通常仅限于单细胞分析，无法同时研究多个卵母细胞，而考虑到卵母细胞提取后的短暂存活时间，这一点尤为重要。传统的卵母细胞渗透性分析方法存在显著的通量和精度限制，限制了其在冷冻保存研究中的实际应用。传统的手动分析方法通常每个卵母细胞需要45-60分钟，包括单独处理细胞、在渗透体积变化过程中手动追踪边界以及计算参数。这一耗时的过程还受到操作者差异的影响，变异系数在15-25%之间，原因包括主观的边界识别、测量时间的不一致以及不同操作者和实验室之间分析协议的不同。这些限制的累积效应严重限制了渗透性研究的规模和统计功效，通常使得研究人员每个实验条件只能分析不到10-15个卵母细胞。这种样本量限制，加上卵母细胞群体的固有生物变异性，影响了渗透性参数确定的统计稳健性，阻碍了优化冷冻保存方案的开发。相比之下，CryoSIM通过全面自动化解决了这些根本性问题。该平台将分析时间缩短至每个卵母细胞不到5分钟，同时可以处理8个细胞，通过标准化的图像分析算法实现了低于3%的变异系数。这代表了分析通量提高了90%以上，并显著提高了可重复性，使得使用传统方法无法实现的较大样本量的渗透性研究成为可能。

CryoSIM平台整合了几项关键创新：具有增强混合和捕获功能的微流控芯片，包括Y形通道、之字形路径和抛物线形微柱阵列，有助于温和、集中地捕获卵母细胞。芯片采用了冷却剂耦合的玻璃基底，实现了稳定的温度控制。我们还开发了MLSNet，这是一种专为明场卵母细胞分割设计的深度学习模型，能够快速准确地估计体积。此外，基于Python的图形用户界面集成了成熟的生物物理模型，可以从时间序列图像数据中自动计算渗透系数（Lp, Ps），支持在多种CPA条件下的高通量、微创分析。

通过将这些组件整合到一个自动化平台上，CryoSIM彻底改变了卵母细胞冷冻保存研究的方式。它提供了无与伦比的通量、精确的温度控制以及从图像采集到渗透性建模的端到端数据处理，同时将人为错误降至最低。这种集成方法为推进生殖生物学、生育力保存方案和更广泛的生物材料应用中的冷冻保存研究提供了可扩展且稳健的工具。总之，它代表了一个结合了微流控技术、基于AI的图像处理和计算建模的新系统，用于研究卵母细胞中的膜传输动态。通过自动化冷冻保存分析过程，该平台为优化生育力保存方案提供了可扩展的高通量解决方案，与传统方法相比，提供了更精确、更可重复的结果。

部分摘录

微流控系统设计、制造和功能集成

该微流控灌注装置旨在通过精确控制流体动力学、温度和细胞捕获来优化冷冻保存效果。集成系统包括一个微灌注室、一个温度控制单元和一个流体控制装置（图1）。微流控芯片具有宽度为200 μm、高度为150 μm的微通道网络，四个CPA入口（直径100 μm）、八个细胞入口和八个出口，支持同时处理多个细胞

多物理场模拟的见解

我们通过COMSOL Multiphysics进行有限元模拟来验证微流控芯片的设计。该模型复制了实际制造设备的精确几何形状和边界条件（图S3），并结合了第S1节中描述的单层流动（Navier–Stokes）和溶质传输（对流–扩散）物理过程。四种CPA溶液（浓度分别为0.5、1.0、1.5和2.0 M）分别以10 μL/min的流速从入口I₁–I₄引入。所有通道壁都设置了无滑移条件，

讨论

本研究提出了CryoSIM，这是一个集成了微流控技术和人工智能的平台，通过全面自动化解决了卵母细胞渗透性分析中的关键问题。该平台在保持高精度的同时，分析通量提高了90%以上，使得以前手动方法无法实现的统计上稳健的渗透性研究成为可能。MLSNet深度学习分割与成熟传输模型的结合提供了可扩展的解决方案

结论

本研究介绍了一个集成平台，该平台结合了定制设计的微流控芯片、通过MLSNet实现的自动化图像分析以及基于Python的图形用户界面，能够在不同的CPA和温度条件下量化卵母细胞膜渗透性，特别是水力传导性（Lp）和溶质渗透性（Ps）。通过自动化图像分割和参数估计，该系统提高了通量、准确性和可重复性，优于传统的手动方法。

CRediT作者贡献声明

Gang Zhao：概念构思、监督。Kashan Memon：撰写——初稿。Muhammad Azam Fareed：撰写——审阅与编辑。Bing Zhang：概念构思、撰写——审阅与编辑。Lingxiao Shen：撰写——审阅与编辑。Zhicheng Liu：撰写——审阅与编辑

利益声明

无。

资助

本工作得到了国家重点研发计划（2023YFF0713900）和安徽省临床医学研究转化项目（编号202204295107020002）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。