《Analytica Chimica Acta》：A Boronate Affinity-Enhanced and PEGylated Cell-Imprinted Platform for Efficient Capture of Circulating Colorectal Cancer cells
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本研究开发了一种新型硼酸亲和力增强的聚二甲基硅氧烷（PDMS）细胞印章材料PBACIP，通过结合微球负载的二氧化硅@二氟硼苯甲酸纳米颗粒、物理印章技术和聚乙二醇（PEG）修饰，实现了对结直肠癌循环肿瘤细胞（CTCs）的高效特异性捕获与可逆释放，解决了现有CTC捕获技术中特异性不足、细胞粘附不可逆等问题，为液体活检技术提供了创新解决方案。
杨宇|安秦晨|宋志昌|罗毅|左朵|白中博|白凤仪|王先华|董林毅
天津医科大学药学院临床治疗与诊断技术实验室，中国天津300070
摘要
背景
结直肠癌（CRC）是全球癌症死亡的主要原因之一，其转移显著影响了患者的预后。通过检测血液中的循环肿瘤细胞（CTCs），这种液体活检方法为早期诊断和监测提供了有前景的非侵入性策略。然而，现有的CTC捕获平台通常存在一些局限性，如特异性不足、试剂消耗量大以及细胞粘附不可逆，这些因素阻碍了后续的分析。包括CTCs在内的癌细胞通常表达较高水平的糖蛋白，这些糖蛋白含有可以与硼酸配体结合的顺式二醇结构。
结果
以结肠癌细胞系HCT-8为模板，开发出一种新型捕获材料，称为PEG化硼酸亲和细胞印迹聚二甲基硅氧烷（PBACIP）。通过光谱和形貌分析证实，该材料具有嵌入SiO2@DFPBA纳米粒子的互补细胞形状腔体。利用SEM、AFM、FT-IR和接触角测量对该材料进行了系统表征，并评估了其捕获性能、特异性和适用性。与对照材料相比，PBACIP对HCT-8细胞的捕获效率更高，这得益于硼酸亲和性和物理印迹的协同效应。它对结直肠癌细胞表现出高度的特异性。在模拟患者血液样本中，PBACIP能够有效捕获稀有肿瘤细胞。重要的是，捕获到的细胞可以存活并用于后续培养和分析。
结论
我们成功开发了一种硼酸亲和性增强的PEG化细胞印迹PDMS材料，用于高效且特异性地捕获结直肠癌CTCs。该平台通过结合特异性捕获、最小的非特异性吸附和温和的细胞释放方式，解决了现有技术的关键局限性，为结直肠癌诊断和监测中的液体活检技术提供了有前景的工具。
引言
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因[1]，[2]。特别是转移性结直肠癌与不良预后和治疗复杂性密切相关[3]。早期检测转移性肿瘤细胞被认为是提高治疗效果和患者预后的关键策略[4]，[5]。因此，开发高灵敏度、高特异性和非侵入性的结直肠癌检测技术具有重要的临床价值和社会意义。
循环肿瘤细胞（CTCs）是指从原发肿瘤脱落进入血液的恶性细胞，对肿瘤转移至关重要[6]。它们携带了原始肿瘤的完整遗传和表型信息，使其成为实时肿瘤评估的理想替代物[7]，[8]。由于可以通过外周血采集非侵入性地获得CTCs，因此CTC检测已成为液体活检和实时监测癌症进展的关键生物标志物[9]，[10]，[11]，[12]，[13]。最近的CTC检测技术主要基于免疫亲和性、物理性质、核酸扩增和微流控技术[12]。虽然基于免疫亲和性和微流控的平台在CTC捕获方面取得了进展，但仍存在一些限制，包括特异性不足、抗体消耗量大（>50 μg/mL）、CTCs逃逸以及细胞粘附不可逆，从而影响捕获后的分子表征[12]，[14]，[15]。因此，需要开发能够实现CTCs特异性捕获且不破坏细胞的高效平台。
分子印迹聚合物（MIPs）是一种具有定制三维腔体的合成材料，可以模拟天然受体的结合位点，具有高稳定性、低成本和可定制的结合特异性的优势。这种类型的液体活检技术可用于疾病检测和监测、新药开发以及治疗方案的选择[16]，[17]，[18]。在各种MIP制造方法中，全细胞印迹使用完整的靶细胞作为模板，在聚合物基质中创建细胞大小和细胞特异性的腔体，从而通过识别靶细胞的独特表面分子模式实现直接和无标记的细胞捕获[19]，[20]。
细胞印迹效率的关键决定因素是印迹基质与靶细胞表面之间的特异性相互作用。与正常组织相比，包括CTCs在内的肿瘤细胞往往表现出蛋白质糖基化的改变[21]，[22]，[23]。多种糖基化类型与结直肠癌有关，包括O-GalNAc糖基化、O-GlcNAcylation、N-糖基化、唾液酸化、糖鞘脂以及糖胺聚糖[24]。已证明几种糖蛋白在肿瘤恶性中起重要作用，并被认为是液体活检的潜在生物标志物[23]，[24]，[25]，[26]。众所周知，糖蛋白含有顺式二羟基（顺式二醇）结构，可以与硼酸配体结合形成pH依赖性的环状酯[27]。由于其高选择性和在捕获和释放（pH切换）方面的便利性，硼酸亲和材料在分子识别、临床诊断、癌细胞靶向和核苷酸分离领域得到了快速发展[28]，[29]，[30]，[31]。然而，尚未有关于使用硼酸亲和材料在全细胞印迹材料中分离和富集结肠癌CTCs的报道。
聚二甲基硅氧烷（PDMS）因其生物相容性、光学透明度高、柔韧性强和经济效率高而成为细胞研究中的常用材料[32]。此外，PDMS表面易于进行化学修饰。然而，像大多数聚合物材料一样，PDMS表面容易非特异性吸附蛋白质和血细胞。因此，需要通过添加聚乙烯醇（PEG）等排斥分子对未印迹区域进行后处理修饰，以减少不需要的细胞吸附。
基于这些特点，本研究以结肠癌细胞系HCT-8为模板，结合硼酸功能化微球、基于PDMS的表面分子印迹和PEG5000修饰，制备了一种新型全细胞印迹材料。对捕获性能进行了系统表征和优化。构建了模拟临床样本，以评估该印迹材料在复杂血液系统中对结直肠癌细胞的捕获效率和特异性，并验证了其进一步分析的可行性。本研究为新型高效CTC捕获材料的发展提供了实验基础和技术支持，从而推动了结直肠癌液体活检技术的发展。
材料与试剂
RPMI培养基1640（批次32021012）和Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，批次10013091）购自Mediatech（美国赫恩登）。胎牛血清（FBS，批次NO.ST200303）购自PAN-Seratech（德国阿登巴赫）。0.25%胰蛋白酶购自Hyclone（美国洛根，批次2360155）。二甲基亚砜（DMSO）和磷酸盐缓冲液（PBS）购自北京Solarbio科技有限公司（中国北京）。4%甲醛
PBACIP的制备
PBACIP的制备包括五个关键步骤：模板细胞固定、硼酸基团引入、PDMS固化、非印迹区域的PEG化以及模板细胞去除（示意图1）。
使用结肠癌细胞系HCT-8作为印迹模板。在印迹前，先用4%甲醛对细胞进行固定。通过添加SiO2@DFPBA纳米粒子来提供硼酸亲和性，以提高捕获效率和选择性
结论
总结来说，本研究成功开发了一种经过PEG5000修饰的硼酸亲和增强型PDMS细胞印迹材料，用于从血液样本中特异性捕获结直肠癌细胞。多种功能组分的协同整合使该材料在特异性、结合效率和捕获效果方面表现出优异的性能。PBACIP平台已成功应用于从小鼠血液中捕获循环肿瘤细胞（CTCs）
CRediT作者贡献声明
安秦晨：可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。罗毅：方法学、数据分析、概念化。宋志昌：验证、方法学、数据分析。王先华：方法学、研究。白凤仪：验证、数据分析。白中博：验证、数据分析。左朵：验证、方法学、数据分析。杨宇：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究。董林毅：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本项工作得到了天津市教育委员会高等教育科学技术发展基金（授权号：2022ZD053）的财政支持。
