Blue-for-Positive：一种基于纸基微流控设备的比色LAMP检测技术，使用蓝移指示剂实现无需仪器的肉眼读取

《Analytica Chimica Acta》：Blue-for-Positive: Colorimetric LAMP detection on paper-based microfluidic devices using a blue-shift indicator for instrument-free naked-eye readout

基于LAMP的微流控纸质检测装置实现黄龙病高灵敏度无仪器诊断

　　

Sandra G. Vlachovsky | Lucas R. Sousa | Fabiana Stolowicz | Adrian Vojnov | Wendell K.T. Coltro | Eduardo Cortón | Federico Figueredo

生物化学系及IQUIBICEN - CONICET，布宜诺斯艾利斯大学（UBA）精确科学与自然科学学院，阿根廷布宜诺斯艾利斯

摘要

背景

环介导等温扩增（LAMP）是一种核酸扩增方法，能够在短时间内以高特异性合成大量DNA。由于其在恒定温度下进行，因此非常适合在传统实验室环境之外进行快速诊断。这些特点使得LAMP适用于即时检测（POC）应用。然而，目前的POC检测方法仍需要专用设备，并且反应体积相对较大，从而增加了每次反应的成本和适用性限制。

结果

本研究报道了一种基于微流控纸的分析装置（μPAD），该装置仅需不到7 μL的LAMP反应样本，即可产生强烈的蓝色信号以区分阳性样本，从而实现肉眼检测，减少了用户的主观性并降低了样本分析的成本。其工作原理基于在μPAD中发生的钼蓝显色和不可逆反应，该反应特别针对核酸扩增产生的高灵敏度副产物焦磷酸盐进行优化。作为概念验证，该装置使用从亚洲 Liberibacter 细菌（导致黄龙病（HLB）的病原体）扩增的产物进行了验证。结果表明，μPAD的灵敏度可与琼脂糖凝胶电泳方法相媲美，能够检测低至75 pg μL^-1的DNA模板，并且与HLB感染柑橘样本的检测结果具有相似的一致性。

意义

这项工作展示了一种先进的分子诊断平台，提供了新型、低成本且可现场部署的μPAD，这些μPAD有可能作为微流控设备中的检测模块，结合了LAMP的稳健性和纸基显色检测的简便性。

引言

环介导等温扩增（LAMP）已成为最稳健且研究最广泛的现场诊断用核酸扩增技术之一，例如用于传染病检测。该技术由Notomi于2000年首次描述，并由Nagamine进一步优化。由于LAMP能在短时间内（<60分钟）产生大量扩增子（约10⁹），因此能够快速检测目标寡核苷酸序列，具有极高的灵敏度。反应在恒定温度（60–65°C）下进行，无需复杂的昂贵设备来产生热循环。此外，简单的提取方法（如煮沸和切碎）也能有效从各种样本类型中释放DNA，进一步凸显了LAMP在现场疾病诊断中的适用性。LAMP设备的进步以及低成本或现场创新的分析方法的应用，推动了临床诊断[4]、[5]、[6]、环境监测[7]、[8]、[9]、食品质量控制[10]、[11]和法医研究[13]、[14]的发展。这些进步使得无需将样本运送至中心实验室即可快速进行检测，显著缩短了周转时间，降低了成本，并促进了现场诊断，尤其是在偏远地区或大规模健康紧急情况下。此外，核酸扩增测试对于生物防御至关重要，特别是在检测和识别病原体方面，对于生物监测至关重要，能够快速准确地识别生物威胁，无论是自然发生的、故意的还是意外的[15]、[16]。 世界卫生组织（WHO）提出了即时检测（POC）的ASSURED标准，即设备应具备经济性、灵敏度、特异性、用户友好性、快速性、稳健性，并能直接提供给最终用户。基于纸的微流控分析装置（μPAD）被认为是将传感器集成到POC应用中最合适的工具之一。纸基底通过毛细作用传输溶液，并具有多种额外优势，如易于使用、适应多种检测策略、低成本和环保[17]。用于检测目的的纸改性方法显示出巨大潜力，同时不会影响POC设备固有的简单性、便携性和用户友好性。例如，用凝胶[18]、[19]、金属有机框架[20]或分子印迹聚合物[21]改性的μPAD表现出改进的分析性能。 在POC应用中，显色检测更为优选，因为颜色变化可以用肉眼或智能手机轻松观察[22]。核酸扩增产物通常通过荧光DNA插入分子或显色染料进行检测[23]。荧光探针在与扩增过程中生成的双链DNA结合时增强发光[24]，而显色指示剂则对游离镁的变化作出反应。随着焦磷酸盐（PPi）在反应中的积累，Mg²⁺逐渐被捕获，导致染料（如羟基萘酚蓝（HNB）和钙黄）发生可见的颜色变化[25]、[26]、[27]。此外，pH敏感指示剂也被用于LAMP的显色读数，因为扩增过程会释放质子，引起这些染料的特征性颜色变化[4]。 直接通过显色方法检测PPi的策略直到最近才被探索，因为之前的研究主要采用电化学检测技术[28]或无机磷酸盐（Pi）的显色检测，后者需要额外的焦磷酸酶水解步骤[29]。在直接检测PPi方面，Hokazono等人的工作（2024年）[30]尤为突出，他们提出了一种基于与Fe形成复合物的显色反应，能够高灵敏度地检测LAMP产生的PPi。Garg及其合作者的工作也值得注意，他们通过使用碳点实现了PPi离子的检测[31]。 在本研究中，我们开发了一种用于直接检测PPi的μPAD，PPi是聚合反应过程中产生的定量副产物。扩增过程中生成的PPi与钼酸盐反应形成高度稳定的有色复合物。与pH或Mg²⁺依赖的指示剂不同，所得信号基本上是不可逆的，并且具有更高的视觉对比度，即使在非常低成本的诊断格式下也能轻松区分蓝色阳性结果和无色的阴性结果，无需仪器即可用肉眼观察。这一特性对于需要简单流程和低成本以实现技术普及和应用的POC设备特别有用。 概念验证是针对导致全球柑橘植物黄龙病（HLB）的病原体亚洲 Liberibacter 细菌（Candidatus Liberibacter asiaticus，简称CLas）进行的。一旦植物感染HLB，就无法恢复其健康，通常只能通过砍伐和焚烧来防止疾病传播[32]。该疾病通过感染性繁殖材料（枝条或植物部分）或其昆虫媒介Diaphorina citri传播，这种昆虫在美洲和亚洲广泛存在。疾病预防计划基于早期检测和根除感染材料。因此，拥有能够快速、灵敏且易于操作的现场诊断方法将非常有用。除了扩增病原体遗传物质的测试外，还在开发其他HLB检测技术，包括检测患病植物产生的挥发性化合物变化的气体传感器[33]，以及通过分析患病叶片荧光模式变化（由于色素积累、离子缺乏和叶绿素降解等因素）的荧光成像分析[34]。LAMP-μPAD是一种替代方案，它通过直接识别CLas的遗传物质来实现疾病检测，完全符合POC设备的ASSURED标准，从而能够迅速根除受感染的树木，阻止疾病传播。

试剂和溶液

聚维吡咯烷酮（PVP，分子量360,000）、聚乙烯醇（PVA，分子量89,000-98,000，水解度≥99%）、(NH₄)₆Mo₇O₂₄、2-巯基乙醇、MgSO₄、KCl、Tris-HCl、Na₂HPO₄、Na₄P₂O₇·10H₂O、(NH₄)₂SO₄、Na₄P₂O₇（四碱式焦磷酸钠）、Tween 20、甜菜碱一水合物、脱氧核苷三磷酸（dNTP）和氧化石墨烯（GO）均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。Bst DNA聚合酶大片段购自英国Ipswich的新英格兰生物实验室（New England Biolabs）。所有用于检测CLas的寡核苷酸均按需订购。

反应和设备优化

钼酸铵常用于酸性溶液中检测无机磷（Pi）[38]。反应分为两个阶段：首先在磷酸盐和钼酸盐之间形成磷酸钼酸盐复合物，随后该复合物被还原为钼蓝，可通过显色或电化学方法进行定量[39]、[40]、[41]。 μPAD的几何设计将酸性钼酸盐与还原剂（2-巯基乙醇）空间分离。

结论

在本研究中，我们证明了LAMP与μPAD的结合能够实现HLB检测的快速简便读数。μPAD的可定制性使其易于适应不同的设备和环境，促进了反应的小型化，降低了成本，并确保了资源有限环境下的兼容性。此处开发的μPAD的侧向流动特性也便于与其他微流控设备结合使用。

CRediT作者贡献声明

Adrian Vojnov： 监督、方法学。 Fabiana Stolowicz： 撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法学、研究。 Lucas R. Sousa： 撰写——初稿撰写、方法学、研究、数据管理。 Sandra G. Vlachovsky： 撰写——初稿撰写、方法学、研究、数据分析。 Federico Figueredo： 撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、概念构思。 Eduardo Cortón： 撰写——审稿与编辑、可视化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

数据可用性

数据可应要求提供。

致谢

本工作得到了布宜诺斯艾利斯大学（UBA）和国家科学技术研究委员会（CONICET）的支持。作者衷心感谢国家科学技术促进局（ANPCyT）（项目编号BID-PICT 2020-04023）和CONICET（项目编号PIP 2023-0047）的财政支持。