TF-TfR1轴：在真骨鱼类的抗菌免疫和肠道稳定性中的作用

铁转运蛋白（OnTF）及其受体（OnTfR1）在尼罗 tilapia 抗菌免疫和铁代谢中的作用研究。通过纯化鉴定 OnTF，实验证实其通过结合 OnTfR1 受体促进吞噬作用和细菌清除，调控 hepcidin 分泌的 BMP-SMAD 信号通路，维持肠道微生态稳定。首次系统揭示 teleost 鱼中铁代谢相关分子功能，阐明 TF-TfR1 轴心在抗感染和菌群稳态中的核心作用。

　　

梁亮穆|曾庆亮|李佩玉|白浩|陈诺|曾凌远|叶建民|尹晓雪

中国广东省广州市，华南师范大学生命科学学院现代水产科学与工程研究所亚热带生物多样性与生物监测重点实验室，邮编510631

摘要

铁（Fe）是一种至关重要的金属，在多种细胞过程中发挥着重要作用。在哺乳动物中的研究表明，转铁蛋白（TF）和转铁蛋白受体（TfR）共同参与铁离子的运输，并有助于抗菌免疫。然而，关于这些成分在硬骨鱼类中的功能和调控机制的系统研究尚缺乏。在本研究中，我们从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的血清中纯化了TF蛋白并对其进行了鉴定。通过一系列实验技术证明，OnTF能够在体内和体外抑制病原菌的增殖。同时，OnTF与细胞表面的OnTfR1受体相互作用，促进吞噬作用和细菌清除，从而为机体提供免疫保护。值得注意的是，OnTfR1通过BMP-SMAD信号通路直接影响OnHepc的分泌。在病原菌感染期间，由于OnTfR1表达下调导致罗非鱼死亡率增加，补充（r）Hepc蛋白可以有效缓解这一现象。此外，OnTfR1还在维持鱼类肠道微生态平衡和抵抗病原菌感染方面发挥着不可或缺的作用。总体而言，本研究首次系统地探讨了参与硬骨鱼类铁稳态调节的分子的功能作用，阐明了OnTF-TfR1轴作为铁离子吸收和代谢调节的核心通路，在抵抗病原菌感染和维持肠道微生物群稳定性方面的重要作用。这些发现为理解铁代谢与先天免疫防御之间的功能关联提供了新的见解。

引言

铁（Fe）是维持从单细胞细菌到人类等多种生物生命所必需的金属之一。它在多种细胞过程中发挥着关键作用，包括氧气运输、DNA合成、核酸修复、细胞生长、细胞代谢和细胞死亡，并参与宿主防御和细胞信号传导（Neves等，2009；Crielaard等，2017；Galy等，2024）。铁缺乏或过量会导致一系列疾病，因此机体具有严格而复杂的铁代谢调节机制，以确保体内铁含量保持在正常生理水平（Zeidan等，2021）。转铁蛋白（TF）是一种重要的铁结合蛋白，在无脊椎动物和脊椎动物中广泛存在，在铁代谢中起着不可或缺的作用。在哺乳动物中，TF是一种单链糖蛋白，分子量为70–80 kDa，由两个保守的铁结合结构域N-叶和C-叶组成（Stafford和Belosevic，2003；Mizutani等，2012）。N-叶的铁结合活性可能高于C-叶，而C-叶则为转铁蛋白受体提供结合位点（Chasteen，1983）。作为一种多功能分子，TF不仅参与铁的运输和代谢调节，还通过隔离铁离子来抵抗病原菌感染，从而在先天免疫防御中发挥多重作用（Singh等，2002；Johnson和Wessling-Resnick，2012；Perera等，2017；Yin等，2018）。此外，TF作为细胞铁转运和吸收的关键参与者，可能影响铁稳态相关分子的转录，如铁转运蛋白（FPN）、血红素加氧酶（HO）、铁蛋白（Ft）和铁调素（Hepc）（McKie等，2001；Nemeth等，2004；Gkouvatsos等，2012）。

转铁蛋白受体1（TfR1）是一种II型同源二聚体跨膜糖蛋白，对TF具有高亲和力，负责介导细胞内的铁运输（Kohgo等，2002；Magda等，2015）。TfR1是铁代谢中细胞铁吸收的核心蛋白。当血液中的Fe³⁺与TF结合形成TF-Fe³⁺复合物时，该复合物会特异性地与细胞表面的TfR1结合并通过“内吞作用”进入细胞（Muckenthaler等，2017）。随后，Fe³⁺从TF上解离并还原为Fe²⁺，然后通过DMT1（二价金属转运蛋白1）进入细胞质。这些Fe²⁺可用于血红蛋白合成、维持酶活性或储存在铁蛋白中（Galy等，2024）。此外，肝细胞表面的TfR1还可以与“铁调素调节相关蛋白转铁蛋白受体2（TfR2）和铁稳态调节因子（HFE）”形成复合物（Muckenthaler等，2017）。它通过竞争性结合相互作用感知血液中的铁水平，并间接调节铁调素的分泌。当血液中铁水平低时，TfR1与HFE的结合更紧密，抑制HFE与TfR2的结合；而当血液中铁水平高时，TF-Fe³⁺优先与TfR1结合，使HFE从TfR1上解离并与其结合到TfR2上，从而激活下游信号通路（例如BMP-SMAD通路），最终促进肝脏合成和分泌铁调素（Hoffmann等，2021；Zhang等，2024）。

越来越多的研究表明，TfR1可能与TF协同参与宿主的抗菌防御（Singh等，2002；Gkouvatsos等，2012）。此外，TfR1是早期溶酶体表面的关键标记物，负责启动吞噬作用（Magda等，2015；Roldán等，2016）。显然，TF不仅通过增强病原菌的铁剥夺作用来提高抗感染能力，还通过核心分子TfR1促进巨噬细胞吞噬和杀死病原菌（Haddad和Belosevic，2009；Perera等，2017）。此外，TfR1很可能在Hepc的表达中发挥重要的调节作用（Hoffmann等，2021；Zhang等，2024）。先前的研究发现TF可以显著促进巨噬细胞对病原体的吞噬作用，但其相关的调控机制仍有待阐明，特别是TfR1是否起着关键作用。更重要的是，关于TF-TfR1轴在调节硬骨鱼类对病原菌感染抵抗力方面的功能特征和潜在机制的研究相对较少。

近年来，在多种硬骨鱼类中发现了TF的存在，包括鲤鱼（Cyprinus carpio L.）（Jurecka等，2009）、 channel catfish（Ictalurus punctatus）（Liu等，2010）、金鱼（Carassius auratus）（Trites和Barreda，2017）以及虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）（Nynca等，2017）。同期，也研究了海鲈鱼（Dicentrarchus labrax）（Neves等，2011）、比目鱼（Scophthalmus maximus）（Yang等，2013）、钝吻鯉（Megalobrama amblycephala）（Ding等，2015）和斑马鱼（Danio rerio）（Li等，2017）的TfR1的遗传结构和表达特征。然而，硬骨鱼类TF和TfR1的生物学功能，如抵抗病原菌、调节吞噬作用以及在铁稳态调节中的重要作用尚未得到证实（Jurecka等，2009；Liu等，2010；Yang等，2013；Ding等，2015；Li等，2017）。在之前的研究中，我们对尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中的OnTF和OnTfR1进行了鉴定、表达分析和基本生物学功能的研究（Yin等，2018；Yin等，2019；Yin等，2020）。结果表明，OnTF和OnTfR1可能参与先天免疫防御，但其背后的分子机制仍需进一步阐明。在本研究中，我们使用分级沉淀和亲和层析法从尼罗罗非鱼血清中纯化了OnTF，并通过LC-MS/MS进行了鉴定。一系列体内和体外实验表明，OnTF显著增强了宿主抵抗病原菌侵袭的能力。进一步的研究发现，OnTF与其受体OnTfR1相互作用，这对促进吞噬作用和细菌清除至关重要。重要的是，我们的发现表明OnTF/TfR1调节铁稳态相关分子的表达，并通过BMP-SMAD信号通路影响铁调素的分泌。此外，OnTF-TfR1轴还在维持鱼类肠道微生态平衡和抵抗病原菌感染方面发挥着不可或缺的作用。本研究为TF-TfR1轴作为硬骨鱼类铁稳态的关键调控网络提供了新的见解，突显了其在早期脊椎动物抗菌免疫过程中的重要作用。

实验部分

尼罗罗非鱼的饲养

本研究中使用的尼罗罗非鱼购自广东省尼罗罗非鱼养殖场，体重范围为150至200克（用于组织样本采集和巨噬细胞分离）以及15–20克（用于RNA干扰实验）。所有鱼都在华南师范大学实验基地的恒温半自动循环水系统中适应至少3周。为了维持最佳饲养条件，养殖水

OnTF的纯化和鉴定

我们从尼罗罗非鱼中分离并纯化了OnTF，通过PEG和饱和硫酸铵沉淀检测到了蛋白质成分（图1A）。结果显示，OnTF的分子量约为70 kDa，并存在于每种沉淀成分中（图1B）。经过免疫亲和层析纯化后，获得了高纯度的OnTF（图1C）。为了了解OnTF聚合物的存在，将纯化的蛋白质变性并还原后进行检测

讨论

转铁蛋白受体1（TfR1）是人类铁代谢途径中的核心铁转运蛋白。其主要功能是介导细胞对铁的吸收，确保细胞生理活动所需的铁供应，同时防止铁过量或缺乏引起的细胞损伤。由于免疫细胞（如巨噬细胞和淋巴细胞）的激活依赖于铁，因此TfR1介导的铁吸收调节了免疫细胞的增殖和分泌

资金支持

本项目得到了2024年广州市基础与应用基础研究年度专项项目（青年博士“航海”项目）（2024A04J3658、2024A04J3581）和国家自然科学基金（32573544、32273160、31972818）的支持。

CRediT作者贡献声明

梁亮穆：撰写 – 原始草案、方法学、实验设计、资金获取、数据分析、概念构建。曾庆亮：验证、方法学、实验设计。李佩玉：方法学、实验设计。白浩：方法学、实验设计。陈诺：方法学。曾凌远：实验设计。叶建民：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源协调、资金获取。尹晓雪：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、资源管理、项目协调、资金管理

利益冲突声明

作者声明与本研究、作者身份或文章发表不存在潜在的利益冲突。

致谢

我们感谢李晓雪博士在国家蛋白质组学研究中心工作期间在蛋白质组学质谱鉴定方面给予我们的帮助。