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该研究通过多代暴露实验评估双氯芬酸对水蚤（Daphnia magna）的生态毒性，发现0.5-5 μg/L（环境浓度）和50-500 μg/L（热点场景）均抑制生长繁殖、引发形态异常及氧化应激，且毒性通过COX抑制和表观遗传（DNA甲基化）机制跨代传递，证实即使低浓度长期暴露也需纳入生态风险评估。
肖圆圆|赵伟琪|段春妮|龚薇波|赵玉菲|张慧玉|聂向平
济南大学生态学系，广州，510632，中国
摘要
布洛芬在水生环境中的广泛存在对水生生物构成了潜在风险。本研究采用多代暴露方法，探讨了布洛芬在大型溞（Daphnia magna）中的跨代毒性，实验浓度范围涵盖了环境观察到的上限值（0.5-500 μg/L）。实验设计包括F0代的直接暴露、持续到F3代的暴露（F3C），以及F3代后停止暴露（F3R）。布洛芬暴露显著影响了大型溞的生长和繁殖能力，导致形态异常，如尾刺弯曲和眼睛畸形，并降低了游泳行为，表现为速度和距离的减少。特别是这些不良影响在后代中持续存在，无论是在F3C还是F3R品系中都有体现。研究显示，布洛芬通过抑制COX酶，干扰了蜕皮和繁殖所需的内分泌信号通路（EcR、CYP314、VTG），同时导致线粒体动态失衡和氧化应激。全基因组亚硫酸盐测序揭示了世代特异性的DNA甲基化模式：F0代出现广泛的表观遗传扰动，F3C代出现“适应性重编程”，而F3R代则表现出“跨代印记”。关键通路（FOXO信号通路、自噬、肌动蛋白组织）的差异性甲基化为观察到的跨代毒性提供了有力的表观遗传证据。总体而言，结果表明，在环境实际浓度（0.5–5 μg/L）下即可产生可测量的不良影响，而在极端/热点暴露情况下（50–500 μg/L），其机制和表观遗传特征最为明显，这突显了将多代评估纳入生态风险评估框架的价值。
引言
布洛芬作为非甾体抗炎药（NSAIDs）的代表药物，因其抗炎、解热和镇痛作用而被广泛使用（Wilkinson等人，2017年；Ribeiro等人，2022年）。全球对布洛芬的需求持续增长，尤其是在COVID-19疫情期间（Kushner等人，2022年），市场报告显示2024年布洛芬市场规模为63亿美元，预计到2033年将达到93亿美元（Sharma & Bhat，2024年）。布洛芬在人体和动物体内不会被完全吸收和/或生物转化，因此母体化合物及其代谢物可能通过尿液和粪便排出，并进入市政废水系统。超过90%的布洛芬残留物及其代谢物最终排放到环境中。布洛芬的广泛使用和持续排放可能导致其在水生环境中的“伪持久性”，从而对非目标水生生物构成潜在风险（Ruziwa等人，2023年）。现有的废水处理技术无法完全去除布洛芬（Lin等人，2023年），导致其在出水和地表水中的浓度范围从ng/L到μg/L（Ahmed等人，2021年）。全球多地均检测到布洛芬的存在，包括中国、英国、希腊和美国的污水处理厂进水（0.004–603 μg/L）（Reyes等人，2021年；Luo等人，2014年），以及巴基斯坦（1.96 μg/L）、加拿大（0.98 μg/L）、法国（8.0 μg/L）、中国（3.5–280 μg/L）（Aguirre-Martínez等人，2013年；Jan-Roblero & Cruz-Maya，2023年；Khan等人，2022年；Wang等人，2025年）。虽然环境监测提供了关于药物存在和时空分布的重要信息，但仅凭浓度数据不足以推断生态风险，尤其是在慢性暴露、混合暴露以及需要长时间观察的效应（如跨代效应）的情况下。越来越多的生态风险评估开始结合基于效应的证据和机制端点，以便捕捉早期的生物扰动和长期种群相关后果，尤其是对于具有伪持久性的药物（Wu等人，2023年）。尽管这些环境浓度远低于许多模式生物的中位致死浓度，但越来越多的证据表明，即使在较低水平下，布洛芬也能干扰生理代谢，引发氧化应激，并对生物体产生遗传毒性和神经毒性效应。有研究报道布洛芬暴露会干扰大型溞（Daphnia magna）和Oreochromis mossambicus中的抗氧化酶（CAT、SOD、GST）活性（Wang等人，2016年；Sibiya等人，2023年），并导致外周血红细胞的细胞毒性和遗传损伤（Campos等人，2023年）。长期低浓度布洛芬暴露还会导致大型溞胚胎和幼体的形态畸形（Grzesiuk等人，2020年）。较高浓度（>10 μg/L）会导致斑马鱼发育迟缓、孵化率和生长率下降、心脏异常、胸鳍畸形和行为改变（David & Pancharatna，2009年）。在种群层面，布洛芬的慢性暴露影响了大型溞的生长和繁殖，最终影响其生活史特征，降低环境适应性，损害种群表现（González等人，2025年；Heckmann等人，2007年）。因此，这些由布洛芬长期和低浓度暴露带来的潜在威胁值得更多关注。
目前，大多数关于布洛芬的生态毒性研究主要集中在其对直接暴露生物（F0代）的急性毒性效应上，对其未暴露后代（F3代）的潜在影响关注较少。然而，越来越多的研究表明，环境污染物暴露不仅会影响当前暴露的生物，还会影响其未暴露的后代，导致后续几代出现类似的表型变化（Nilsson等人，2018年）。例如，从未直接暴露于苯并三唑的F3代大型溞幼体中观察到了显著的体型变化（Im等人，2023年）。这种由父母代暴露引起的跨代效应或跨代可塑性值得进一步关注。它从根本上改变了生态风险评估框架，因为一些在传统检测中被认为低毒性甚至无毒的污染物可能具有潜在的跨代毒性。跨代可塑性的潜在机制与生物体的表观遗传学有关（Heard & Martienssen，2014年；Fitz-James & Cavalli，2022年），指的是不涉及DNA序列改变的基因表达和表型变化。这些修改，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控，可以引起生理（如生长、繁殖）、行为和寿命的可遗传变化（Du等人，2016年；Padilla Suarez等人，2023年）。目前，关于布洛芬对水生非目标生物的跨代效应的研究仍然有限。鉴于布洛芬在水生环境中的“伪持久性和生物累积潜力（29），迫切需要开展长期多代暴露研究，以更准确地反映自然条件（Castro等人，2018年）。
为了评估布洛芬对水生非目标生物的长期生态风险，我们在大型溞中进行了多代暴露研究，实验浓度范围涵盖了环境观察到的上限值。具体来说，0.5–5 μg/L代表环境实际的地表水浓度，而50–500 μg/L则用于模拟极端/受废水影响的热点情况，并支持在持续压力下的机制解析（Lin等人，2023年）。研究目的包括：（1）量化对生长、发育和繁殖的多代效应；（2）评估对游泳行为和能量代谢的影响；（3）阐明跨代持续性的潜在机制，重点关注内分泌调节和表观遗传变化。这项工作有望为药物污染物的生态风险评估提供基于效应和机制的证据。
化学试剂
布洛芬（CAS：15687-27-1，纯度>98.0%，MACKLIN，上海，中国）用二甲基亚砜（DMSO，CAS：67–68–5，分析级试剂，Sigma，美国）作为溶剂，溶解在去离子水中（通气48小时），制备浓度为0.5 g/L的储备溶液。所有其他试剂均来自商业供应商，符合分析级标准。
大型溞的维护
实验中使用的大型溞
布洛芬暴露抑制大型溞的生长和繁殖
长期布洛芬暴露显著影响了所有测试世代（F0、F3C、F3R）的大型溞的生长和繁殖表现。与对照组相比，F0代的体长显著减少（4.7%–14%）。在连续暴露三代后（F3C），这种抑制效应更为明显（9.8%–14.6%的减少）。值得注意的是，即使在停止暴露后（F3R），体长也显著减少（7.5%–11.2%）（图2A）。
讨论
本研究采用多代设计，评估了大型溞在环境相关浓度下长期暴露的跨代毒性，包括F0代的21天暴露、F3代的持续暴露（F3C），以及暴露后的F3代停止暴露（F3R，其中‘R’表示停止外部暴露）。结果表明，布洛芬抑制了体生长（体长减少）、降低了蜕皮频率，并影响了
结论
本研究表明，在环境相关浓度下长期暴露于布洛芬会导致大型溞的跨代毒性，这在F0代、F3持续暴露组（F3C）和F3停止暴露组（F3R）中都有体现。布洛芬显著减缓了生长，减少了蜕皮次数，延迟了繁殖开始，并损害了繁殖表现。形态异常包括尾刺弯曲、眼睛畸形和发育缺陷
作者声明
我们声明本手稿是原创的，其结果未在其他地方部分或全部提交发表。所有作者均知晓并同意此次提交。所有作者的贡献如下：
所有作者如下：
聂向平（通讯作者）：概念构思、方法学、资金获取、监督、初稿撰写、审稿与编辑。
肖圆圆（第一作者）：概念构思、数据管理、正式分析
CRediT作者贡献声明
肖圆圆：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、软件使用、资源准备、方法学研究、数据分析、概念构思。
赵伟琪：研究。方法学研究。
研究。
研究。
张慧玉：研究。
聂向平：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、项目管理、资金获取、数据分析
