磷酸肌酸通过激活Nrf2/ARE抗氧化通路并维持内皮细胞的完整性，减轻异丙肾上腺素引起的心脏纤维化

《Archives of Biochemistry and Biophysics》：Phosphocreatine attenuates isoproterenol-induced cardiac fibrosis via activation of the Nrf2/ARE antioxidant pathway and preservation of endothelial integrity

本研究通过建立ISO诱导的小鼠心脏纤维化模型，探讨PCr的潜在保护作用。结果显示，PCr显著减轻心肌纤维化，通过激活Nrf2/ARE通路抑制氧化应激和纤维细胞活化，同时维持内皮完整性，降低心肌损伤标志物。该研究为PCr治疗心脏纤维化提供了新机制依据。

　　

吴柳|埃斯坎达尔·卡埃德|瓦利德·阿尔达马什|穆埃阿塔兹·A·马尤布|瓦利德·阿里·海兰|阿卜杜勒拉赫曼·哈立德·阿尔韦萨比|唐泽尧|马尔万·阿尔莫伊利基

大连医科大学药理学系，中国大连市鲁迅南路西段9号，116044

摘要

背景

磷酸肌酸（PCr）是一种高能量磷酸供体，具有已知的细胞保护和抗氧化特性，已知能够支持内皮功能。然而，其在调节心脏纤维化中的作用仍不明确。本研究旨在确定PCr是否能减轻异丙肾上腺素（ISO）诱导的心脏纤维化，并探讨核因子红系2相关因子2/抗氧化应答元件（Nrf2/ARE）信号通路的潜在作用。

方法

通过皮下注射ISO建立小鼠心脏纤维化模型。小鼠接受PCr治疗，然后分析心脏组织中的组织病理学变化、胶原沉积以及氧化应激、内皮完整性和成纤维细胞活化的标志物。通过免疫印迹和免疫荧光技术评估Nrf2及其下游抗氧化酶（包括血红素加氧酶-1（HO-1）和超氧化物歧化酶（SOD）的表达和核转位。测量血清肌酸激酶-MB（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH）水平以评估心肌损伤。

结果

ISO注射诱导了明显的心脏纤维化，表现为胶原过度积累、氧化损伤、肌成纤维细胞激活和内皮功能障碍。PCr治疗显著保护了心肌结构并减少了间质胶原沉积。PCr治疗与Nrf2的核转位增加以及HO-1和SOD的上调相关，同时通过降低丙二醛（MDA）水平表明脂质过氧化减轻。此外，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和I型胶原的表达下调，这些发现突显了PCr在预防心脏纤维化和不良心肌重塑方面的治疗潜力。PCr还维持了内皮完整性（增加CD31表达）并降低了血清CK-MB和LDH水平，表明ISO诱导的心脏损伤得到缓解。

结论

PCr具有强大的抗纤维化和抗氧化保护作用，并与Nrf2/ARE信号通路的激活、成纤维细胞活化的抑制以及内皮功能的维持相关。这些发现突显了PCr在预防心脏纤维化和不良心肌重塑方面的治疗潜力。

引言

心脏纤维化是导致多种心血管疾病（包括心力衰竭、扩张型心肌病、心肌梗死和高血压性心脏病）的重要病理过程[1,2]。其特征是心肌血管周围和间质区域中外基质（ECM）蛋白（主要是I型和III型胶原）的过度积累[3,4]。过度沉积会损害收缩和舒张功能，破坏正常的心肌结构，并降低心室顺应性[5]。持续的纤维化会导致心室硬化、心律失常性重塑和心力衰竭风险增加。开发减少心脏纤维化的方法并了解其根本原因仍然是重要的治疗目标[6]。异丙肾上腺素（ISO）注射是一种广泛使用的实验模型，因为它能够有效复制与人类心脏损伤相关的各种病理特征。ISO是一种合成的β-肾上腺素能激动剂，可引起持续的交感神经过度刺激，导致炎症、氧化应激、成纤维细胞激活和心肌细胞损伤[7]。长期暴露于ISO会导致弥漫性间质纤维化、心室扩张和收缩功能障碍，使其成为研究细胞和分子通路以及评估潜在心脏保护疗法的相关模型[8,9]。氧化应激是ISO诱导的心脏纤维化的重要因素。活性氧（ROS）的过量生成会促进心肌重塑、外基质（ECM）沉积和成纤维细胞激活。Nrf2/ARE抗氧化通路是抵御氧化应激的关键细胞防御机制。Nrf2在激活后转位到细胞核，以减少氧化损伤，并与血红素加氧酶-1（HO-1）和超氧化物歧化酶等抗氧化基因的表达相关[10],[11],[12],[13]。靶向Nrf2/ARE通路可能有效预防ISO诱导的心脏纤维化。纤维化重塑主要是由内皮功能障碍和成纤维细胞激活共同引起的[14]。内皮损伤会加速氧化应激、炎症和成纤维细胞增殖。内皮调节血管张力、屏障功能和心肌灌注[15]。CD31（PECAM-1）的存在常用于评估血管完整性，表明其可能抑制纤维化并维持心肌稳态[16]。磷酸肌酸（PCr）是一种内源性高能量磷酸分子，对维持ATP稳态至关重要，并且是细胞能量代谢的重要组成部分。除了其代谢功能外，PCr还具有心脏保护作用，包括减少氧化应激、稳定细胞膜、减轻钙超载以及在心力衰竭、缺血和再灌注损伤条件下改善收缩性能[17],[18],[19],[20]。先前的研究表明，磷酸肌酸在心脏损伤模型中具有抗纤维化作用。例如，戴等人[21]证明PCr可以减轻异丙肾上腺素诱导的心脏纤维化和心肌细胞凋亡，而费等人[22]报告称PCr通过调节MAPK和NF-κB通路来减轻大鼠心肌细胞中的血管紧张素II诱导的纤维化。这些发现为研究PCr的心脏保护作用提供了基础。然而，对于PCr对ISO诱导的心脏纤维化的潜在影响，特别是其对内皮完整性和Nrf2/ARE介导的抗氧化防御机制的影响，了解仍然有限。本研究旨在评估PCr在预防小鼠ISO诱导的心脏纤维化方面的潜力。本研究重点关注其维持CD31介导的内皮完整性、抑制成纤维细胞激活、减少氧化应激和激活Nrf2/ARE抗氧化通路的能力。阐明这些过程有助于揭示PCr作为心脏纤维化创新治疗方法的潜力。

材料

哈尔滨莱博腾制药公司（中国哈尔滨）提供了磷酸肌酸（PCr）。Sigma-Aldrich提供了异丙肾上腺素（ISO），用于通过持续的β-肾上腺素能刺激诱导心脏纤维化（美国密苏里州圣路易斯）。用于分子和组织学分析以评估内皮完整性、抗氧化反应和成纤维细胞激活的一抗（针对I型胶原、α-SMA、Nrf2、HO-1和CD31）购自Elabscience生物技术公司（中国武汉）。

PCr治疗可减轻ISO诱导小鼠的心脏纤维化并保护心肌结构

PCr治疗显著减少了ISO诱导小鼠的心脏纤维化。使用H&E和Masson's Trichrome染色进行组织学分析显示，20 mg/kg和50 mg/kg剂量的PCr显著减少了胶原沉积并保持了心肌结构（图1A和B）。CD31的免疫组化染色表明，PCR治疗保护了内皮完整性和微血管密度，而这些在ISO处理的心脏中受到了损害。

讨论

心脏纤维化是心血管疾病的重要病理特征，会导致心肌硬化、收缩力下降、心律失常，最终导致心力衰竭[23]。本研究表明，磷酸肌酸（PCr）通过多种相关途径对异丙肾上腺素（ISO）诱导的心脏纤维化具有显著的保护作用。这些途径包括激活Nrf2/ARE抗氧化通路、减少氧化应激等。

结论

我们的研究表明，磷酸肌酸（PCr）通过激活Nrf2/ARE抗氧化通路、抑制成纤维细胞激活以及降低α-SMA和I型胶原的表达，显著减轻了ISO诱导的心脏纤维化。PCr减轻了氧化应激，减少了炎症细胞因子的释放，并保持了CD31阳性内皮细胞的完整性，从而保护了心肌微环境。这些多靶点效应突显了PCR的

伦理声明

作者确认所有动物实验均获得大连医科大学伦理委员会的批准（许可号SCXK2024-00022）。所有程序均遵循ARRIVE指南，并符合1986年英国《动物（科学程序）法案》、欧盟指令2010/63/EU以及NIH《实验室动物护理和使用指南》（NIH出版物编号8023，1978年修订版）规定的伦理标准。所有措施均已实施

资助

作者感谢沙特阿拉伯利雅得国王沙特大学的持续研究资助计划（ORF-2026-1080）的支持。

CRediT作者贡献声明

吴柳：概念构思、数据管理、正式分析、撰写及审稿编辑。埃斯坎达尔·卡埃德：概念构思、数据管理、资金获取、监督、撰写及审稿编辑。瓦利德·阿尔达马什：监督、撰写及审稿编辑。穆埃阿塔兹·A·马尤布：撰写及审稿编辑。瓦利德·阿里·海兰：撰写及审稿编辑。阿卜杜勒拉赫曼·哈立德·阿尔韦萨比：撰写及审稿编辑。唐泽尧：撰写及审稿编辑。马尔万·阿尔莫伊利基：撰写及审稿编辑。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢沙特阿拉伯利雅得国王沙特大学的持续研究资助计划（ORF-2026-1080）的支持。