母体分离对小鼠幼崽发声声学结构的异质性影响

《Behavioural Brain Research》：Heterogeneous effects of maternal separation on the acoustic structure of mouse pup vocalizations

本研究探讨单次24小时母婴分离（MS）对ICR小鼠幼崽超声发声（USVs）声学特征的影响。通过分析P4、P6、P8、P11和P14日USVs的持续时间、平均频率及频率变异系数，发现MS组在P6时高频率簇USVs数量显著减少，低频率簇的频率变异度降低，提示早期压力选择性影响特定发声类型，为神经内分泌与发声模式关联研究提供依据。

　　

西堀亮 | 伊藤幸 | 猪崎沙织 | 秋山基树 | 玉井雄太 | 元山淳 | 小林康太

日本京都同志社大学生命与医学科学研究生院

摘要

早期生活逆境是导致社交和沟通障碍发展的主要风险因素。母体分离（MS）已在啮齿动物模型中进行了研究；然而，其对声音交流发展轨迹的影响仍不清楚。在本研究中，我们调查了母体分离对ICR小鼠超声波发声（USVs）的影响。小鼠在出生后第4天（P4）经历了24小时的母体分离，并在P4、P6、P8、P11和P14记录了USVs。每个音节都分析了持续时间、平均频率和频率变化系数（cvfreq），后者反映了频率调制范围。使用k-means聚类方法将USVs分为低频和高频两组。尽管两组在整体发展模式上相似，但在分离后的P6阶段出现了具体差异。在高频组中，母体分离组产生的USVs数量少于对照组，尤其是“chevron”类别明显减少。在低频组中，母体分离组的cvfreq降低，“step-down”类别也显著减少。这些变化在其他声学参数或呼叫类别上没有显著的组间差异。我们的发现强调了早期生活压力后声音障碍的特定类型性质。母体分离似乎不是简单地抑制或激发声音行为，而是选择性地改变特定USV类型的复杂性和数量。这些变化突显了未来研究将早期生活压力相关的神经内分泌信号与声音变化联系起来的关键目标。

引言

早期生活压力对哺乳动物（包括人类）的神经发育和行为有长期影响[1]。当个体经历过度压力时，例如与照顾者长时间分离，在关键发育期间下丘脑-垂体-肾上腺轴可能会发生持续改变，可能引发影响认知、情绪和社会功能的表观遗传变化[2]、[3]、[4]、[5]。这些发现表明早期生活压力如何导致后续的精神疾病。

在啮齿动物中，超声波发声（USVs）是评估情绪状态的可靠指标。例如，高频USVs（约50 kHz）与积极情绪状态相关，而低频USVs（约20 kHz）与消极情绪状态相关[6]、[7]。此外，当小鼠或大鼠幼崽与母亲分离时，它们会发出USVs作为求救信号，以吸引母亲的注意并引发照顾行为[8]、[9]。在这种情况下，幼崽的USVs通常被视为内部状态的代理指标，反映了唤醒、类似焦虑的反应以及寻求母亲照顾的动机驱动等情感和生理因素的结合。重要的是，USV测量并不假设以一对一的方式映射到单一的内部状态；相反，呼叫率和声学结构的变化被解释为这些潜在状态的变化。此外，幼崽的USVs通过其声学结构明显传达了动物内部状态和情绪状况的具体信息，可能影响母亲的行为和随后的社会互动[10]、[11]。根据频率调制和持续时间等声学变量，幼崽的USVs可以分为几种音节模式[7]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。然而，这些音节模式是随机生成的还是传达了特定的交流信息仍有争议，尚未完全阐明[17]。

母体分离（MS）是一种常用的实验范式，用于模拟啮齿动物的早期生活压力[18]。MS会破坏母亲与其后代之间的互动，并据报道会导致神经内分泌系统的长期变化[19]、[20]、[21]。根据最近的一项系统综述[22]，MS方案大致可以分为两种类型：重复MS，通常涉及多天内每天60-480分钟的分离；以及单次MS，即幼崽连续24小时与母亲分离。重复MS与记忆缺陷和类似抑郁的行为风险增加有关，尽管其影响可能因品系和性别而异[23]、[24]、[25]。相比之下，单次MS会引起更严重的应激反应，往往导致更明显的行为和生理后果[26]。我们之前使用单次24小时MS方案在小鼠出生后第4天（P4）到第5天（P5）的研究表明左海马神经元数量减少[27]。与生理和行为症状相比，关于USVs影响的研究相对较少。值得注意的是，MS对USV产生的影响在不同研究中有所不同。例如，在C57BL/6J幼鼠中，一些研究报道MS压力不会影响USV的产生[28]，而在某些大鼠品系中，重复MS压力会减少幼崽发出的USVs数量[29]、[30]。在我们的蒙古沙鼠研究中，我们发现从P7到P8的单次24小时母体分离导致成年后社交发声数量的长期变化[31]。多项研究已经考察了重复MS对USVs的影响；然而，据我们所知，尚未有研究调查单次MS方案对小鼠的影响。

本研究旨在通过评估单次MS压力对发声模式的影响，来研究早期生活压力条件下小鼠幼崽USVs的声学特征。为此，我们选择了杂交ICR小鼠，这种小鼠可以在不同的遗传背景下检测到MS的影响。该品系在社交测试中的表现与C57BL/6J相当[32]。我们研究了单次24小时MS事件是否改变了幼崽USVs的声学结构，并通过标准化的声学分析，试图揭示MS对USVs声学结构的系统影响。

实验部分

研究对象

所有实验均遵循同志社大学的动物实验指南进行。怀孕的ICR小鼠（妊娠12天）从Shimizu Laboratory Supplies购买，并饲养在装有木屑作为垫料的标准化塑料笼子中。所有小鼠都饲养在空调房间内（温度：22±1°C，相对湿度：50-60%），光照周期为12:12（早上7:00到晚上7:00），并可自由获取食物和水。本研究使用了四只母鼠。

母体分离对体重的影响

在P4、P5（分离后）、P6、P8、P11和P14测量了幼崽的体重（图1）。这些数据使用双因素混合设计ANOVA进行分析，年龄作为组内因素，组别（对照组 vs. MS）作为组间因素。分析显示年龄（F (1.259, 47.83) = 2085, p < 0.001）、组别（F (1, 38) = 41.34, p < 0.001）以及年龄 × 组别的交互作用（F (1.259, 47.83) = 14.46, p < 0.001）具有显著意义。事后采用Bonferroni校正。

讨论

在包括ICR在内的多种小鼠品系中，幼崽的USVs数量从出生后第0天（P0）开始增加，在P6左右达到峰值，然后在大约P14时消失[8]、[36]、[37]、[38]。在本研究中，对照组表现出类似的发展过程（图2A）。USVs已被广泛记录为幼崽神经发育和应激反应的可靠指标[9]。因此，如MS这样的压力源会影响发声数量和各种声学特征。

资金来源

本工作得到了JSPS KAKENHI资助，项目编号为22K18661、23KJ2084和23K12938。

未引用参考文献

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作者贡献声明

伊藤幸：撰写 – 审稿与编辑、验证、资源获取、项目管理、方法论、研究、资金获取、概念构思。西堀亮：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、软件使用、项目管理、方法论、研究、资金获取、数据分析、概念构思。猪崎沙织：研究。小林康太：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理

致谢

我们感谢Hiryu教授和Tachibana Ryosuke O博士在本实验中提供的宝贵建议。