热敏性、pH值和离子强度响应性的MPEG–PEI共聚物：一种可逆的、从可溶状态变为不溶状态的载体，有助于葡糖淀粉酶的固定及催化反应的持续进行

《Biocatalysis and Agricultural Biotechnology》：Thermo, pH, and ionic-strength-responsive MPEG–PEI copolymer: A reversible soluble–insoluble support promotes glucoamylase immobilization and sustainable catalysis

本研究构建了基于可逆溶解/不溶解MPEG-PEI共聚物的固定化葡萄糖淀粉酶（GA），优化了MPEG:GA比例，使酶保留12.6%理论活性，并表现出优异的操作稳定性和重复使用性。底物辅助固定化（使用麦芽糖或麦芽糊精）显著提升酶活性，麦芽糖在11次循环后仍保持70%初始活性。动力学分析表明固定化GA的Km值升高，可能由构象变化引起，同时验证了MPEG-PEI共聚物的热响应特性，为工业应用提供新思路。

　　

Nazife Isik Haykir|Hacim Kosao?lu|Ali Tuncel|Serdar S. ?elebi

德国亚琛工业大学（RWTH Aachen University）过程系统工程系，52074，亚琛，德国

摘要

葡糖淀粉酶（GA）在食品和发酵工业中淀粉及其他相关寡糖的糖化过程中起着关键作用。本文介绍了一种利用可逆溶/不溶性甲氧基聚乙二醇-聚乙烯亚胺（MPEG–PEI）共聚物制备的固定化葡糖淀粉酶的方法。通过研究不同的MPEG:GA比例，优化了酶的负载量和催化活性。固定化的葡糖淀粉酶保留了高达12.6%的理论活性，并表现出优异的操作稳定性和可重复使用性。在载体合成过程中，利用麦芽糖和麦芽糊精对酶的活性位点进行保护，显著提高了酶的活性——与未受保护的系统相比提高了3.1倍。虽然麦芽糊精的初始活性较高，但麦芽糖的长期稳定性更好，在经过11次重复使用后仍能保持70%的初始活性。使用Lambert-W函数进行的动力学分析显示，固定化酶的K_m值增加，表明其活性位点的构象可能发生了变化，从而导致底物亲和力降低。尽管在高初始底物浓度下转化效率略有下降，但可逆溶/不溶性MPEG–PEI共聚物仍表现出有效的热响应特性，使其能够在淀粉水解中持续且可回收地使用，为未来的生物技术应用提供了巨大潜力。

引言

酶已成为多个行业技术创新的关键组成部分，这一趋势受到全球向可持续工业实践转变的推动，包括碳捕获、生物燃料生产和环境修复等领域。为了充分发挥酶的潜力，人们正在努力提高其在各种工业应用中的活性、特异性、可重复使用性和稳定性（Bergeson和Alper，2024；Radley等人，2023）。

葡糖淀粉酶（GA）是用于淀粉酶解的生物催化剂的核心。它从非还原端切割末端葡萄糖单元，释放出葡萄糖（Marín-Navarro和Polaina，2011），在食品、生物燃料、纺织和酿造等多个工业领域中具有广泛应用（Kumar和Satyanarayana，2009；Zong等人，2022）。2021年，属于碳水化合物酶类的GA占据了全球工业酶市场的最大份额，市场规模约为25.9亿美元，占总市场的40.37%（Bergeson和Alper，2024）。这种市场主导地位凸显了GA的重要商业价值。然而，由于最终转化率低、热稳定性差以及可重复使用性有限，固定化GA的工业应用仍然受到限制，这些因素共同降低了其成本效益和操作效率（Maghraby等人，2023）。最近，人们通过酶的固定化技术来克服这些限制。Zong等人（2022）通过对1991年至2021年三十年的文献进行统计分析，确定了GA发展的三大研究热点：固定化、菌株改良和在生物乙醇生产中的应用（Zong等人，2022）。

多种固定化技术显著提高了GA的性能，尤其是在活性、热稳定性和可重复使用性方面；然而，这些技术往往伴随着一些权衡，如底物亲和力降低（K_m值增加和最终转化率降低）或部分活性损失。表1展示了几种具有优异稳定性和良好可重复使用性的固定化GA系统的详细信息，使其在工业应用中具有吸引力。在现有的固定化方法中，共价结合仍然是主流方法，因为它能够在酶和支撑材料之间形成稳定且持久的连接（Brena等人，2013；Prabhakar等人，2025）。先前的一项高效系统使用了经过乙二胺、戊二醛和硼氢化钠改性的3D打印PLA载体，固定化GA在6小时内实现了超过90%的淀粉到葡萄糖的转化率（自由态GA为62.05%），使用12小时后转化率仍为95%（Junior等人，2025）。该系统在三次10分钟的循环后仍保留了65.19%的活性。然而，固定化GA在热稳定性和酸性pH条件下的稳定性较低，表现为更高的失活速率（k_d）和更短的半衰期（t_1/2）。用聚乙烯亚胺（PEI）和戊二醛活化的κ-卡拉胶凝胶珠固定的GA在11次重复使用后仍保持100%的初始活性，但底物亲和力略有下降（K_m值从110 mM增加到147.46 mM），V_max值从2.28 μmol glucose min^-1降低到1.11 μmol glucose min^-1（Hassan等人，2019）。一种纳米结构的支撑材料——氧化石墨烯-Fe₃O₄-氰尿酸（GO/MNP-CC）复合材料在20次循环后仍保留了超过96%的初始催化活性和超过56%的活性（Amirbandeh和Taheri-Kafrani，2016）。另一方面，固定化导致K_m值略有增加和V_max值降低，表明底物亲和力和催化效率下降。K_m值的增加可能是由于构象变化或空间位阻限制了底物对活性位点的访问。Tardioli等人报告称，固定化GA在热失活实验中保持了50%的初始活性，并表现出比自由态酶高500倍的稳定性（Tardioli等人，2011）。另一项研究中，用聚戊二醛活化的明胶延长了GA的操作寿命，在30天后仍保持100%的初始活性，90天后仍保持75%的活性，尽管K_m值略有增加和V_max值降低（Tanriseven和?l?er，2008）。Milosavi?等人使用碳水化合物偶联技术在多孔聚（甘油甲基丙烯酸酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯）支撑材料上实现了固定化，获得了高比活性（1100 U g^-1），在333K下的热半衰期延长了2倍，并且四周内葡萄糖产量稳定（Milosavi?等人，2007）。Wang等人提高了固定化GA的稳定性，在338K下6小时后仍保留62.3%的活性，而自由态酶的活性仅为43%。固定化GA在10次重复使用后仍保持约68.4%的活性，表明其具有良好的可重复使用性（Wang等人，2013）。这些研究结果表明，尽管通常观察到K_m值增加和V_max值降低，但酶的固定化仍能保证足够的操作稳定性和可重复使用性。最近，Addai等人通过将固定化技术与机器学习引导的酶工程相结合，缓解了GA固定化中的活性-稳定性权衡（Addai等人，2025）。在55°C下30分钟后，自由态GA完全失活，而固定化酶的比活性增加了约3.9倍，并保持了约43%的活性。该系统在热稳定性方面有所改善，尽管K_m值略有增加（Addai等人，2025）。

在涉及固定化酶的系统中，底物和产物的扩散受限是一个物理现象，即使酶的固有活性不变，也会导致表观反应速率减慢和观察到的活性降低。为了解决这个问题，一些先前的研究专注于酶固定化的材料创新。Bolivar等人指出，酶固定化仍是一个不断发展的领域，并鼓励开发更多针对特定应用的、设计良好的策略，例如定制载体和定向固定化技术（Bolivar等人，2022）。因此，需要进一步的研究来合理设计既能保持酶天然活性又能提高稳定性的固定化系统。本文提出了一种使用可逆溶/不溶性MPEG–PEI共聚物（图1）作为载体的新方法。如图1所示，支化的聚乙烯亚胺（PEI）段构成了富含胺的骨架，而甲氧基聚乙二醇（MPEG）段则是线性的–O–CH₂–CH₂–O–链，末端带有甲氧基，与PEI共价连接。亲水功能团（羟基和胺基）和相对疏水段的共存赋予了该共聚物两亲性。

这种方法通过将GA固定在均匀且可溶的相中，减少了底物和产物的传质阻力，从而允许进行更精确的动力学分析。使用批次实验和非线性回归分析（Lambert-W函数）系统评估了固定在相变共聚物上的GA的动力学性能，以确定其K_m值。这项工作展示了使用可逆溶/不溶性共聚物在生物催化中的潜在优势，并提供了对酶性能的更深入的机制理解。

材料

支化聚乙烯亚胺（PEI，分子量：60 kDa）、单甲氧基聚乙二醇（MPEG，分子量：2 kDa）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自Sigma-Aldrich（德国）。葡糖淀粉酶和麦芽糖来自Merck（德国），而葡萄糖和标准葡萄糖溶液来自VWR Chemicals BDH。DE 14的麦芽糊精由Cerestar（荷兰）提供，DE 4–7的麦芽糊精由Sigma-Aldrich提供

确定GA固定化的最佳组成

MPEG是一种非常灵活且亲水的聚合物（Bento等人，2024）。这些特性提高了支撑材料在水环境中的适用性，使酶更容易与载体结合。通过创造更有利的微环境，MPEG还有助于保持酶的构象完整性。尽管相关研究较少，但它已被用于酶的固定化（Baysal和Uslan，2000；Yang等人，2017）。

结论

本研究提出了一种使用可逆且热响应性的MPEG–PEI共聚物的新平台，该平台通过提供可逆的溶解性、降低的传质阻力以及改进的动力学建模潜力，克服了传统固体载体的局限性。虽然葡糖淀粉酶被用作模型酶，但所开发的MPEG–PEI共聚物平台也适用于其他需要提高稳定性和可重复使用性的酶。

CRediT作者贡献声明

Hacim Kosao?lu：撰写——原始草稿、方法论、研究、概念化。Nazife Isik Haykir：撰写——审稿与编辑、撰写——原始草稿、可视化、概念化。Serdar S. ?elebi：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资源管理、项目管理、方法论、概念化。Ali Tuncel：验证、监督、资源管理、项目管理、方法论、概念化

伦理批准和参与同意

不适用。

出版同意

所有作者均已阅读并同意最终稿件的发表。

数据和材料的可用性

支持本研究结果的数据可向相应作者索取。

利益冲突

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

资助

本研究未获得任何公共、商业或非营利机构的资助。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

不适用。