在293T细胞中，当Naringenin Chalcone和HRH2结合后，基因表达和可变剪接现象会以不同的方式发生改变

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Gene expression and alternative splicing are observed to shift in different ways after binding of Naringenin Chalcone and HRH2 in 293T Cells

组胺H2受体（HRH2）激活引发基因表达和可变剪接变化，黄柏素查耳酮通过剂量依赖性调控影响HRH2介导的生物学过程。RNA测序显示，低剂量黄柏素查耳酮改变细胞信号通路富集，高剂量则与组胺单独作用相似，提示其调节机制与HRH2信号层叠。研究发现HRH2激活主要调控氧化磷酸化，而黄柏素查耳酮显著影响RNA剪接相关基因表达，60%以上差异剪接基因与差异表达基因重叠，但黄柏素查耳酮特异调控比例低于20%。本研究为解析植物成分与GPCR互作机制提供新证据。

　　

谢庄源|徐国清|莫静|何太平|丛兆通|冷亮|郑传

成都中医药大学药学院，中国成都611137

摘要

组胺H2受体（HRH2）是组胺信号传导的关键介质，调节胃酸分泌并参与免疫调节。柚皮素查尔酮是一种天然查尔酮化合物，也是一种重要的合成中间体。先前的研究表明，柚皮素查尔酮可以结合HRH2并抑制HRH2诱导的cAMP生成。在这里，我们使用RNA测序来表征HRH2激活引发的转录组和可变剪接变化，并评估柚皮素查尔酮如何调节这些反应。组胺激活HRH2后，诱导了11,507个差异表达基因（DEGs），这些基因主要与细胞质翻译和氧化磷酸化相关。低剂量的柚皮素查尔酮使富集方向转向中心体组装和突触信号传导，而高剂量处理产生的模式与单独使用组胺相似，这表明其效应具有浓度依赖性。与单独使用组胺相比，高剂量的柚皮素查尔酮改变了2,794个基因的表达，这些基因主要与RNA剪接相关。我们进一步分析了具有差异转录使用的基因（gDTUs）。在组胺处理下，gDTUs富集在核基质和组蛋白甲基转移酶活性相关基因中，而柚皮素查尔酮则使富集方向转向RNA剪接及其调控相关基因，这一模式与基于DEGs的结果一致。与基线293T细胞相比，超过60%的gDTUs与DEGs重叠；然而，在研究柚皮素查尔酮的特定影响时，重叠比例降至20%以下。这些发现表明，柚皮素查尔酮对基因表达和可变剪接有差异性影响，尽管这些调控机制可能最终导致相似的生物学结果。总体而言，我们的研究为柚皮素查尔酮与HRH2之间的分子相互作用提供了新的见解，并为进一步的机制研究提供了参考。

引言

组胺于1910年由英国科学家Henry H. Dale和P. P. Laidlaw从紫色毛壳菌（Claviceps purpurea）中首次分离出来[1]。1927年，Best及其同事从肝脏和肺组织中成功分离出组胺，证实它是人体内的内源性化合物[2]。后续研究表明，组胺广泛分布于各种人体细胞类型中，其中嗜碱性粒细胞和肥大细胞是其主要的合成和释放部位[3],[4]。组胺通过激活四种不同的G蛋白偶联受体（GPCRs）来发挥其生物学作用：组胺H1受体（HRH1）、组胺H2受体（HRH2）、组胺H3受体（HRH3）和组胺H4受体（HRH4）。这些受体的激活会触发独特的细胞内信号级联反应，从而调节多种生理功能[5]。其中，HRH2与Gs蛋白结合，刺激环腺苷单磷酸（cAMP）的积累，进而调节下游细胞过程[6]。迄今为止，大多数关于HRH2配体的研究都集中在抑制胃酸分泌的拮抗剂上。西咪替丁是首个上市的HRH2拮抗剂，但由于具有抗雄激素活性和药物相互作用等不良副作用而被停止使用[7]。更安全的替尼丁也在检测到致癌污染物N-亚硝基二甲胺（NDMA）后在全球范围内被撤出市场[8]。目前，法莫替丁仍是临床实践中最常用的HRH2拮抗剂。除了调节胃酸外，HRH2还参与免疫激活和炎症调节。研究表明，组胺诱导的HRH2激活可以通过cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）途径抑制白三烯（LT）的合成[9]。此外，在小鼠肺炎模型中，HRH2缺乏会导致不变自然杀伤T细胞（iNKT）数量增加，从而加剧炎症[10]。

然而，已知的大多数HRH2配体要么是内源性的（如组胺），要么是合成的（如法莫替丁），关于天然产物配体的研究相对较少。天然产物具有丰富的结构多样性、广泛的生物活性和较低的生产成本，使其成为发现新药物的宝贵资源。

查尔酮是一类重要的酚类天然产物，广泛存在于甘草等植物中，作为关键的次级代谢物[11]。查尔酮及其衍生物具有多种生物活性，包括抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌、细胞毒性和免疫抑制作用[12]。例如，Raphael Stoll等人证明查尔酮可以抑制癌蛋白MDM2与p53的相互作用，恢复p53功能以促进细胞凋亡并抑制肿瘤进展[13]。同样，S. H. Lee等人报告称，异荛素可以通过细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）途径在RAW264.7巨噬细胞中诱导血红素加氧酶-1（HO-1）的表达，从而减轻巨噬细胞介导的炎症[14]。此外，S. Mohan等人发现从Boesenbergia rotunda中分离出的Boesenbergin A可以通过减少体内氧化应激和炎症来改善乙醇引起的胃溃疡[15]。在植物中，大多数查尔酮是通过查尔酮合酶的作用合成的，该酶催化三个丙二酰-CoA分子和一个4-香豆酰-CoA分子缩合生成4,2′,4′,6′-四羟基查尔酮（也称为柚皮素查尔酮）。这种中间体随后经过进一步的酶修饰生成多种查尔酮衍生物[12]。因此，柚皮素查尔酮是大多数查尔酮的关键生物合成前体。先前的研究表明，柚皮素查尔酮可以抑制组胺的释放[16]并对花生四烯酸诱导的炎症具有抗炎作用[17]。基于我们之前开发的基于全基因组的pan-GPCR靶标发现范式和筛选平台[18],[19]，我们的团队通过细胞膜色谱和分子对接技术鉴定出柚皮素查尔酮是一种潜在的HRH2结合化合物。使用基于GloSensor的cAMP测定方法，我们进一步证实了柚皮素查尔酮可以抑制HRH2激活诱导的cAMP积累[20],[21]。基于这些发现，我们旨在阐明柚皮素查尔酮对HRH2调节的生理后果。

配体-受体相互作用通常会引发复杂的生理反应。根据分子生物学的中心法则，基因表达是通过DNA转录成mRNA，然后翻译成蛋白质来进行的。然而，在高等生物中，这一过程并非一对一的。在转录过程中，前体mRNA（pre-mRNA）会经历调控性的剪接，只有部分核苷酸序列（外显子）被保留并连接形成成熟的mRNA，然后翻译成蛋白质。大多数pre-mRNA包含多个可变外显子。特定外显子被选择性地包含或排除以生成不同的成熟mRNA异构体的过程称为可变剪接。这种机制使单个基因能够产生多种转录变异体，编码功能多样的蛋白质异构体，这是人类基因组复杂性的主要贡献因素[22],[23]。因此，要理解配体-受体相互作用引起的生理变化，必须研究转录动态，包括可变剪接事件的变化。

传统的基因表达分析主要关注整体基因表达水平的变化。然而，许多基因表现出由可变剪接驱动的差异性转录使用。这些基因在总基因表达上的差异通常很小，因此在常规基因表达分析中经常被忽视。尽管如此，它们可能在基因功能调节中发挥作用。为了解决这一限制，本研究在柚皮素查尔酮与HRH2结合后同时鉴定了差异表达基因和具有差异转录使用的基因。这两组基因都进行了基因本体论（GO）和京都基因组与基因百科全书（KEGG）富集分析，以进一步探讨差异基因表达和差异转录使用之间是否存在共同的调控机制。

实验部分

细胞培养

HEK293T细胞由Procell生命科学技术有限公司（中国武汉）提供。细胞在添加了10%胎牛血清（VivaCell，上海）和1%青霉素-链霉素（Gibco，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）中培养。培养条件为37°C，含5%二氧化碳的湿润环境。

质粒转染和药物处理

将HEK293T细胞以每孔6 × 10^5个细胞的密度接种到六孔板中，并在37°C下培养过夜

HRH2的过表达及柚皮素查尔酮的干预

在这里，我们在293T细胞系中过表达HRH2，然后用不同浓度的柚皮素查尔酮预处理10分钟，随后进行24小时的组胺处理，并进行转录组测序。（图1A、B）。

与转录组测序同时，我们收集样本使用qRT-PCR测定细胞中的HRH2 mRNA水平。结果显示，HRH2 mRNA水平显著高于正常293T细胞（图1C）

讨论

在之前的研究中，cAMP测定表明柚皮素查尔酮可以抑制HRH2激活后的cAMP生成。在本研究中，我们选择柚皮素查尔酮的EC50浓度（40 μM）作为低浓度处理组（HLNC），并在cAMP测定中显示最强抑制效果的浓度（100 μM）作为高浓度处理组（HHNC）。然后进行转录组测序（RNA-seq）以分析基因表达的变化

结论

本研究系统地研究了组胺和柚皮素查尔酮对293T细胞基因表达和转录使用的影响。我们的结果表明，组胺会引起广泛的转录和剪接变化，特别是影响线粒体代谢、氧化磷酸化和染色质相关过程。柚皮素查尔酮以剂量依赖的方式调节这些由组胺驱动的反应：低浓度似乎可以减弱

CRediT作者贡献声明

丛兆通：方法学、实验设计。冷亮：写作-审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。郑传：监督、资金获取。谢庄源：写作-审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学、实验设计、数据分析、概念构思。徐国清：验证、方法学、数据分析。莫静：方法学、实验设计。何太平：方法学、实验设计

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文研究的利益冲突。

数据可用性

本研究中使用的测序数据可从国家基因组数据中心（NGDC）公开获取，网址为：https://ngdc.cncb.ac.cn/bioproject/browse/PRJCA052109

资助

本研究得到了四川省中医药管理局的专项资助，用于“基于GPCR的中药筛选技术创新平台”项目；以及四川省自然科学基金（编号：2024ZDZX0019）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文研究的利益冲突。

致谢

我们感谢实验室所有成员提供的宝贵建议和技术支持。