《Biochemical and Biophysical Research Communications》：SNCA (α-synuclein) H50Q mutation reveals distinct neurodegenerative patterns and adaptive responses in Parkinson's disease
Drosophila model
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帕金森病（PD）研究利用果蝇模型对比SNCA野生型和H50Q突变体的神经毒性，发现突变体后期出现运动障碍，但通过增强抗氧化机制（如 catalase活性降低提示氧化应激）提升生存率，解释了H50Q突变延迟发病的机制。
Jennifer Sally Samson|Kalyanaraman Rajagopal|Venkatachalam Deepa Parvathi
印度金奈斯里拉玛昌德拉高等教育与研究学院生物医学科学系
摘要
帕金森病（PD）的特征是中脑多巴胺能神经元的进行性退化，这一过程与α-突触核蛋白的聚集密切相关。矛盾的是，尽管SNCA H50Q突变与人类家族性PD的延迟发病有关，但它在体外实验中会增强α-突触核蛋白的聚集和细胞毒性，这突显了阐明调节疾病进展的分子机制的必要性。在这项研究中，我们使用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）作为体内模型，来研究野生型（SNCA WT）和突变型（SNCA H50Q）在PD进展过程中的神经毒性。我们进行了一系列行为学、生物化学和神经解剖学分析。通过对不同年龄组（第10天、第20天和第30天）的攀爬和运动追踪实验，发现SNCA WT果蝇表现出逐渐加重的运动功能障碍，同时中心回避指数增加，表明姿势不稳定和运动迟缓。SNCA H50Q果蝇在晚期表现出明显的运动迟缓，表现为运动距离缩短和运动输出减少。对石蜡脑切片和眼睛的定性组织学评估以及扫描电子显微镜（SEM）分析显示，SNCA H50Q果蝇存在形态学变化。生物化学分析表明SNCA WT果蝇有补偿性的抗氧化反应，而SNCA H50Q果蝇的过氧化氢酶活性降低，表明其氧化应激增强。在结合遗传学和罗通宁（rotenone）诱导的PD模型中，SNCA H50Q果蝇的存活率更高，表明其可能激活了适应性应激响应机制。总体而言，这些突变特异性表型强调了体内模型在阐明调节疾病发作和进展的适应性机制方面的重要性。
引言
α-突触核蛋白被认为是帕金森病（PD）病理过程中路易小体（Lewy Body, LB）形成的关键成分，二十年前就有研究提出它与家族性PD有关[1,2]。编码这种蛋白质的基因SNCA位于4q22.1染色体上[3]。自1997年首次报道与SNCA A53T突变相关的家族性帕金森病以来[1]，研究人员还发现了其他几种错义突变以及基因重复和三倍体，这些因素导致了罕见的家族性PD[4][5][6]。重要的是，SNCA基因的突变会导致常染色体显性遗传模式的家族性PD。
SNCA H50Q突变涉及α-突触核蛋白中的组氨酸到谷氨酰胺的替换，它与人类晚发性帕金森病（60-63岁发病）相关[7][8][9]，而早期发病的E46K和A53T突变则不同。矛盾的是，多项体外研究表明，H50Q突变会加速α-突触核蛋白纤维的形成，并对其聚集倾向产生不同的影响[10][11][12][13]。最近的研究发现了两种独特的遗传性H50Q突变诱导的α-突触核蛋白多态性，即窄纤维和宽纤维形式，这些多态性表现出更快的纤维形成动力学、更高的种子形成能力和增强的细胞毒性[14]。因此，鉴于体外实验中显示的H50Q（α-突触核蛋白）增强的聚集潜力和细胞毒性，人们可能会预期神经退化的发生会更早。然而，携带SNCA H50Q突变的患者往往在较晚的年龄才出现症状[7][8][9]，尽管该突变具有更高的细胞毒性。这种体外观察到的严重聚集倾向与临床上的晚发性表现之间的明显差异，突显了H50Q突变的生物学独特性，并暗示可能存在特定于突变的、年龄依赖性的补偿或适应机制，这些机制可能调节疾病的发作和进展。阐明这些过程需要使用体内模型来识别影响神经退化时间动态的突变特异性因素。
黑腹果蝇是一种无脊椎非哺乳动物模型生物，已被广泛用于研究包括神经退行性疾病在内的多种疾病的分子生物学[15]。由于其生命周期短、遗传学特征明确、能够行走和攀爬、寿命相对较短以及伦理问题较少，这种生物在帕金森病研究中具有很高的应用价值[16]。迄今为止，使用SNCA H50Q果蝇模型的体内研究主要集中在表征突变特异性表型，特别是运动障碍、神经退行性和代谢变化[17][18][19]。然而，整合年龄依赖的运动动力学、氧化应激调节、α-突触核蛋白和环境毒素诱导的神经毒性以及相关神经解剖学变化的全面体内评估在Ddc-GAL4驱动的H50Q（α-突触核蛋白）帕金森病果蝇模型中仍不够充分。这种综合分析对于阐明调节疾病发作和进展的突变特异性机制至关重要。在本研究中，通过使用Ddc-GAL4驱动子在果蝇模型中限制α-突触核蛋白的表达，可以评估多巴胺能和5-羟色胺能神经元群体的行为、神经解剖学和生物化学表型，从而捕捉帕金森病发病机制的关键特征。
我们研究了两种转基因果蝇模型：Ddc-GAL4/+;UAS-SNCA WT+/+和Ddc-GAL4/+;UAS-SNCA H50Q+/+，以探讨这些SNCA变异体相关的不同疾病结果。这些果蝇与其相应的对照组一起被系统地评估了一系列与PD相关的表型，包括攀爬（负地性）实验以及在定义的时间点对七个关键运动参数的详细追踪。使用苏木精和伊红（H&E）染色以及扫描电子显微镜（SEM）分析了果蝇大脑和复眼中的帕金森病相关神经退行性变化。
在之前的研究中，气味敏锐度缺陷先于运动障碍出现，并在氧化应激下加剧[20]，从而表明气味敏锐度是α-突触核蛋白介导的神经退行的早期功能标志。基于此，我们检查了野生型和突变型果蝇模型的气味敏锐度，以确定这些SNCA变异体是否导致类似的早期多巴胺能脆弱性。还分析了两种SNCA果蝇模型中的乙醇诱导的镇静和恢复动态，以评估这些指标作为功能性神经元损伤的潜力。
为了评估帕金森病进展过程中的氧化应激，我们量化了关键的抗氧化酶活性和氧化应激标志物。我们进一步研究了这些遗传模型对罗通宁（ROT）的敏感性，罗通宁是一种广泛研究的环境性线粒体毒素，使用遗传学和毒素诱导的帕金森病模型来评估果蝇在神经毒性条件下的存活能力。进行了寿命测定，以估计在Ddc-GAL4介导的基因表达下的SNCA果蝇模型的寿命。这种综合方法提供了对SNCA相关病理性的多维度体内分析。这些发现可能有助于解释H50Q相关帕金森病中α-突触核蛋白聚集增强与症状延迟发作之间的矛盾，从而加深我们对突变特异性帕金森病发病机制的理解。
节选
果蝇品系和杂交
本研究中使用的所有果蝇品系均来自经过认证的果蝇品系中心。GAL4驱动线（Ddc-GAL4/+）和UAS响应线（UAS-SNCA WT+/+）来自印度迈索尔大学的国家果蝇品系中心，而GMR-GAL4/+驱动线来自印度浦那的印度科学教育与研究学院（IISER）。突变果蝇模型（BL-80045 w[?]; P{w[+mC]=UAS-hSNCA.H50Q}2/CyO）由S. C. Lakhotia教授提供。
SNCA转基因果蝇模型中攀爬能力的基因型和年龄依赖性调节
通过Wilcoxon秩和检验（第10天，p = 0.0001142；第20天，p = 0.00009536；第30天，p = 0.003264），发现UAS-SNCA WT+/+和Ddc-GAL4/+;UAS-SNCA WT+/+果蝇在每个年龄段的攀爬能力存在显著差异（图4A–C）。同样，通过Wilcoxon秩和检验（第10天，p = 0.000103；第20天，p = 0.0421；第30天，p = ）发现UAS-SNCA H50Q+/+和Ddc-GAL4/+;UAS-SNCA H50Q+/+果蝇在每个年龄段的攀爬表现也存在显著差异。
讨论
SNCA基因（α-突触核蛋白）因其在中散发性及家族性帕金森病发病机制中的主要作用而受到广泛研究。由于该蛋白具有聚集形成有毒寡聚体的倾向，这会损害线粒体功能并促进ROS积累，因此明确不同SNCA突变相关的神经退化程度非常重要。在本研究中，我们研究了SNCA变异体（即野生型和H50Q）在转基因果蝇中的效应。
结论
目前的发现表明，携带H50Q突变的患者可能存在类似的补偿机制，这些机制可能缓冲α-突触核蛋白引起的毒性，从而延缓临床症状的出现，尽管该突变具有更高的细胞毒性。此外，我们的结果表明，果蝇帕金森病模型是进行系统和比较性临床前评估的宝贵体内平台，有助于在早期识别治疗策略。
伦理批准
已获得机构动物伦理委员会的批准，日期为2022年10月11日。
资助
本研究未获得公共、商业或非营利部门的任何特定资助。这项工作是Jennifer Sally Samson博士的博士研究项目的一部分，该博士研究由印度金奈SRIHER的创始人校长Shri. NPV Ramasamy Udayar奖学金资助。
CRediT作者贡献声明
Jennifer Sally Samson：概念构思、形式分析、研究、方法论、撰写——初稿。Kalyanaraman Rajagopal：验证、撰写——审阅和编辑。Venkatachalam Deepa Parvathi：概念构思、数据管理、研究、项目管理、监督、验证、撰写——审阅和编辑。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们衷心感谢S.C. Lakhotia教授提供UAS-SNCA H50Q+/+果蝇品系。我们感谢Sathyabama科学技术学院的Viswanathan Kanagasabai博士在FESEM分析方面的帮助，也感谢Sundaram S. Gnanasekaran先生在组织学检查方面的支持。
