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土壤微生物群落及功能基因对反复冻融循环的响应机制研究。通过施加1、3、7、15次冻融循环，分析土壤微生物生物量碳氮动态变化及温室气体排放特征。研究发现微生物生物量碳氮在3次循环后达到最低点，随后逐渐回升；溶解有机碳氮和硝态氮呈现先增后减趋势；酶活性及功能基因丰度普遍受抑制，但后期呈现适应性恢复；CO?排放脉冲式增强，N?O排放则在7次循环后显著增加。揭示冻融循环中微生物群落从被动响应转向主动适应的动态机制。
杨晓艺|胡雅娴|李浩乐|李贤文|魏晓荣
中国西北农林科技大学水土保持科学与工程学院，土壤与水资源保护国家重点实验室，陕西省杨陵市712100
摘要
季节性冻融过程（FT）会深刻地改变土壤微生物群落的结构。然而，除了横断面比较之外，关于土壤微生物如何逐步适应反复冻融循环中的变化条件，目前仍知之甚少。在这项研究中，一种黑土（Mollisol）经历了1次、3次、7次和15次的冻融循环（分别称为C1、C3、C7和C15），每次循环在-10°C下冻结12小时，然后在10°C下解冻。在C1、C3、C7和C15之后测量了土壤的生化性质，并每天监测了CO?和N?O的排放量。研究结果表明：（1）随着冻融循环次数的增加，土壤微生物的生物量碳和氮含量先减少后增加，两者在C3后达到最低值（分别比C1减少了10.6%和39.8%）。（2）相比之下，溶解有机碳（DOC）和NO??-N的含量先增加后减少，两者在C7后达到最大值（分别比C3增加了15.0%和9.3%）。溶解有机氮（NH??-N）在整个冻融循环过程中持续增加。（3）与非冻融处理相比，冻融处理后的土壤中酶活性普遍降低了11.0%至62.5%，与碳和氮循环相关的功能基因的丰度先减少，然后在C7后趋于有效恢复。（4）总体而言，多次冻融循环显著增加了CO?排放量（36.0%）和N?O排放量（69.3%）。我们的发现表明，土壤微生物的生物量和功能基因的丰度在反复冻融循环中从被动响应转变为主动适应，有助于加深我们对土壤微生物在气候变化条件下的恢复能力和越冬策略的理解。
引言
季节性冻融过程（FT）影响着北半球55%的陆地土壤（Zhang等人，2003年；杨雅娴等人，2024年）。在高山泥炭地，冻融季节的CO?排放量占年总排放量的44%（刘晓等人，2021年），而在某些季节性冻结的土壤中，冬季到春季的N?O通量占年排放量的58%–85%（Yanai等人，2011年）。反复的冻融循环会破坏土壤结构（Oztas和Fayetorbay，2003年），导致土壤微生物群落的死亡或重组（Larsen等人，2002年；Neilsen等人，2001年），并释放额外的溶解有机物（DOM）（Grogan等人，2004年；Elliott和Henry，2009年；Gao等人，2021a）。这些变化进一步改变了存活微生物的碳利用策略（Campbell等人，2014年；Su等人，2010年），最终影响土壤温室气体的排放和碳氮循环（Wu等人，2020年；M?rkved等人，2006年）。然而，随着冻融循环次数的增加，土壤的物理化学和生物响应往往表现出非线性模式。一方面，经过一定次数的反复冻融循环后，土壤团聚体和孔隙分布趋于达到新的平衡（Starkloff等人，2017年；杨雅娴等人，2024年）。另一方面，早春时温室气体的脉冲式释放表明，土壤微生物群落对反复的冻融循环具有相当的适应性，使大多数种群能够存活甚至有效恢复（Liu等人，2020年；Peng等人，2019年）。然而，目前关于土壤微生物对冻融扰动的响应的知识主要基于冻融前后（包括模拟冻融循环或冬季）的横断面比较。关于土壤微生物的丰度和功能如何适应反复冻融循环中的变化条件，仍知之甚少。
先前的研究通常认为，在冻结过程中，温度的急剧下降会促进冰晶的形成和体积膨胀，这会破坏大团聚体并压缩小团聚体，从而改变孔隙结构（杨雅娴等人，2024年；刘斌等人，2021年；Starkloff等人，2017年；肖等人，2019年），同时还会侵入或压缩微生物细胞，造成直接的物理损伤（Gao等人，2018年；Sawicka等人，2010年）。解冻时，冰融化成水，但冰膨胀造成的变形是不可完全逆的。新形成的孔隙网络和破坏的团聚体促进了之前被保护的有机物的暴露和释放（Six等人，2004年；Elliott和Henry，2009年），这反过来又刺激了CO?和N?O的排放（Wang等人，2014b；Peng等人，2019年）。同时，裂解的微生物细胞补充了土壤中的DOM池（Freppaz等人，2007年；Wu等人，2017年），有助于更多耐寒微生物从冻融引起的渗透压应力或物理扰动中恢复（Feng等人，2007年；Ruiqi等人，2023年）。冻融期间温度和营养条件的变化也会重新组织土壤微生物群落，由于真菌对渗透压的耐受性更强，真菌通常比细菌存活得更好（Magan，2007年）。存活的微生物群落通过功能基因的表达调整酶的产生和活性（Sang等人，2021年；Luo等人，2020年），从而改变碳利用策略，增强硝化作用，进而放大CO?和N?O的排放（Peng等人，2019年）。我们之前的研究还发现，土壤微生物的生物量碳和呼吸产生的CO?排放对增加的冻结梯度（Liu等人，2022b）、延迟的冻结时间（胡雅娴等人，2023年）、不同的初始水分水平（Liu等人，2025年）以及不同大小的颗粒（Liu等人，2022a）的反应不同。然而，目前对冻融响应的理解主要基于单次或有限次冻融事件前后土壤微生物性质的比较。关于存活的微生物功能如何在反复的冻融循环中逐步适应，仍缺乏明确的研究。
先进的技术（例如CT扫描）显示，冻融引起的土壤物理结构损伤在最初的几次循环中最为明显（Tian等人，2019年）。随着冻融循环次数的增加，冻融引起的结构变形并不是简单的重复或强化，而是趋于达到新的平衡（刘斌等人，2021年）。例如，土壤的体积应变、孔隙率和微观结构在3-6次冻融循环后趋于稳定（杨雅娴等人，2024年；谢等人，2015年）。尽管单次冻融事件可以消除超过50%的微生物种群（Morley等人，1983年；Sawicka等人，2010年），但早春时的微生物丰度通常仍保持在冻融前秋季水平的50%左右（Larsen等人，2002年；Feng等人，2007年）。多项研究进一步表明，在反复的冻融应力下，微生物活性趋于稳定而不是持续下降（Li等人，2020年；M?nnist?等人，2009年）。例如，Wang等人（2014a）发现，泥炭地中的微生物活性在冻融循环增加时先减少后增加。这些观察结果共同表明，土壤微生物的丰度和功能在反复冻融循环中从“被动响应”转变为“主动适应”。然而，关于土壤微生物在反复冻融循环中的存活策略和适应机制，仍需要更系统的研究。
中国东北部的黑土地区是一个典型的季节性冻融区（Wang等人，2008年；Yue等人，2021年），在该地区，晚秋和早春期间大约有10-15天的日冻融循环（Yue等人，2021年）。该地区不仅是中国的主要粮食生产区（Luo等人，2021年），还支持广泛的森林和草原生态系统（Ni等人，1999年）。实地观察证实，冻融循环显著改变了不同土地利用类型的土壤水热状况（Wang等人，2023年），实验室模拟进一步表明，冻融扰动显著改变了黑土中的微生物丰度、群落结构、功能特征和CO?排放（Kang等人，2024年；Wang等人，2014b）。然而，在未来的气候条件下，年平均温度的上升以及年温差范围的缩小预计将导致永久冻土边界向北移动（杨雅娴等人，2024年），同时扩大季节性冻结土地的范围，并改变冻结深度和频率（Biskaborn等人，2019年；Frauenfeld等人，2004年）。因此，明确土壤微生物群落及其功能如何应对反复冻融循环中的极端水热条件变化，对于深入理解季节性冻融过程及其气候反馈至关重要。
在这项研究中，一种当地的黑土（Mollisol）经历了四种不同的冻融情景（1次、3次、7次和15次冻融循环），以比较不同冻融循环下土壤微生物丰度、与碳氮循环相关的功能基因丰度以及CO?和N?O排放率的响应。我们假设有限的冻融循环次数可能会对土壤微生物群落和代谢活动造成严重破坏，但增加的冻融循环不会无限地强化冻融引起的损伤，而是通过改变功能基因和酶活性触发自我适应策略，帮助受损的土壤微生物群落有效恢复。
研究区域和土壤采样
研究区域位于内蒙古自治区阿尔山（47°12′N，119°55′E，海拔976米），这是大兴安岭森林区腹地的一个典型黑土区域，主要由兴安落叶松覆盖。阿尔山地区全年温度较低（年平均温度为-3.2°C），无霜期短暂（90天），冬季漫长（210天），夏季短暂而温和。最低温度达到了-45.7°C，最高温度为……
不同冻融循环下SMBC和SMBN的变化
随着冻融循环次数的增加，SMBC和SMBN先减少后增加，在C3后达到最小值，此时C3/N15的比值为0.59（图2）。到C15时，SMBC和SMBN显著增加，比值分别达到0.99和0.98，与N15相当（图2）。DOC、DON、NO??-N和NH??-N的含量列在补充材料中（表S3）。
不同冻融循环下土壤DOC、DON、NO??-N和NH??-N的变化
总体而言，经过冻融处理的土壤中的DOC含量显著增加（C15除外）
土壤微生物丰度和活性对增加的冻融循环的非线性响应
在前几次冻融循环（即C1和C3）后，SMBC、SMBN、酶活性和功能基因丰度显著下降，而在C7和C15期间则出现反弹（图2、图4、图5），这表明土壤微生物丰度和活性的响应并非线性变化，而是具有韧性和适应性。基于我们之前的研究，土壤团聚体……
结论
根据选定的黑土对模拟冻融循环的微生物响应，我们主要观察到前几次冻融循环（C1～C3）对土壤微生物群落造成了破坏性影响，迫使它们被动应对冰晶机械损伤，导致土壤微生物生物量大幅减少，同时从裂解的细胞中释放出易分解的有机物质。在3到7次冻融循环之后（C3～C7），稳定的土壤结构使耐寒微生物能够积极……
作者贡献声明
杨晓艺：撰写——原始草稿、可视化、验证、项目管理、调查、正式分析、数据管理、概念化。胡雅娴：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念化。李浩乐：可视化、验证、项目管理、调查、正式分析。李贤文：监督、项目管理、方法学、概念化。魏晓荣：撰写——审稿与……
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2024YFD1502000）和国家自然科学基金（42477373, 52279049）的财政支持。
