《Frontiers in Immunology》：Mitochondrial dysfunction and immune microenvironment in gestational diabetes mellitus: insights from bioinformatics analysis and experimental validation
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本研究通过整合GSE203346（批量RNA-seq）和GSE173193（单细胞RNA-seq）转录组数据与MitoCarta3.0线粒体基因集，结合LASSO、随机森林（RF）和XGBoost三种机器学习算法，鉴定出DHRS2、STX17和TIMM44三个核心线粒体相关基因（Mito-RGs）。基于这三个基因构建的Mito-RGs评分（Mito-RGs score）联合临床变量建立的列线图（nomogram）能有效预测妊娠期糖尿病（GDM）。单细胞RNA-seq分析揭示了GDM胎盘组织中上皮细胞、巨噬细胞和自然杀伤（NK）细胞比例增加，而组织干细胞比例显著减少，且不同细胞类型中分别富集了糖酵解、缺氧及炎症激活等相关通路，表明线粒体功能障碍促进了胎盘免疫微环境的促炎性重编程。最后，该研究在GDM患者胎盘组织和高脂饮食（HFD）诱导的GDM小鼠模型中对关键基因进行了免疫组化验证，证实了DHRS2表达显著升高，为理解GDM的病理机制和寻找干预靶点提供了新思路。
引言
妊娠期糖尿病是一种在妊娠期间发生或首次识别的以高血糖为特征的常见并发症，全球发病率约14%。它不仅损害母体健康，增加剖宫产、2型糖尿病和心血管疾病风险，还会导致胎儿巨大儿、新生儿低血糖和长期代谢紊乱等不良结局。尽管GDM带来了巨大的公共卫生负担，但其进展的机制仍未完全阐明。线粒体是复杂的双膜细胞器，除了通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP）外，还对钙调节、活性氧（ROS）产生、免疫信号传导和细胞凋亡至关重要。越来越多的证据表明，线粒体功能障碍通过破坏胎盘的代谢信号传导和促进氧化应激，在GDM的病理变化中起着关键作用。同时，免疫失调也被证明是GDM发展的关键因素。胎盘组织中存在巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞亚群等免疫细胞浸润的改变，这些细胞与滋养层细胞密切相互作用，创造出一种促炎环境，加剧了胰岛素抵抗。线粒体功能障碍与免疫失调似乎紧密交织，形成恶性循环。本研究旨在利用生物信息学与实验验证相结合的方法，探索线粒体相关基因在GDM中的作用及其与免疫微环境的相互作用，为GDM的早期诊断和有效治疗策略提供新的见解。
材料与方法
基因表达数据集从GEO数据库获取，包括GDM和健康妊娠的批量RNA-seq数据集（GSE203346，含21例GDM和22例对照）以及胎盘组织样本的单细胞RNA-seq数据（GSE173193，含2例GDM和2例对照）。从MitoCarta3.0数据库中提取了1136个线粒体相关基因列表。使用R包“limma”鉴定GDM组与对照组之间差异表达的Mito-RGs，标准为|log2FoldChange (FC)| > 0.585且校正P值 < 0.05。通过GO、KEGG和GSEA对差异基因进行功能富集分析。采用三种机器学习算法——最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归、随机森林（RF）和极端梯度提升（XGBoost）来识别核心Mito-RGs。基于核心基因，通过多变量逻辑回归计算Mito-RGs评分，并联合临床变量构建预测GDM的列线图。使用ImmuCellAI算法评估胎盘组织中不同免疫细胞类型的浸润水平。对单细胞RNA-seq数据进行了质量控制、归一化、主成分分析（PCA）降维和基于图的聚类，并使用Uniform Manif Approximation and Projection（UMAP）进行可视化。通过SingleR进行细胞类型注释。使用“AddModuleScore”函数在单细胞水平计算Mito-RGs评分，并通过基因集变异分析（GSVA）和单细胞GSEA分析不同细胞类型的生物学功能差异。利用“CellChat”包基于配体-受体相互作用推断细胞间通讯网络。从山东第一医科大学附属教学医院收集了GDM孕妇和健康对照的胎盘组织样本。通过高脂饮食（HFD）喂养诱导C57BL/6-J小鼠建立GDM模型，并通过口服葡萄糖耐量试验（OGTT）确认模型成功。对人和小鼠胎盘组织进行免疫组化染色，以评估脱氢酶/还原酶成员2（DHRS2）、突触融合蛋白17（STX17）和线粒体内膜转位酶44（TIMM44）的蛋白表达。
结果
差异表达的Mito-RGs及其功能富集分析
通过与MitoCarta3.0数据库比对，在GSE203346数据集中共鉴定出29个在GDM样本中显著上调的差异表达Mito-RGs。火山图和层次聚类热图可视化了这些基因的分布和表达模式。功能富集分析显示，这些基因在氧化还原酶活性、脂肪酸结合和小分子代谢等生物过程中显著富集。KEGG通路分析表明它们参与了柠檬酸循环（TCA循环）、脂肪酸代谢和谷胱甘肽代谢等代谢途径。基因集富集分析（GSEA）进一步揭示，在GDM中，与线粒体膜组织、线粒体外膜通透性（涉及程序性细胞死亡）和线粒体呼吸链复合物组装相关的通路受到显著抑制。
通过机器学习算法鉴定GDM中的核心Mito-RGs
LASSO回归通过10折交叉验证选择了22个基因，RF和XGBoost算法各自筛选出重要性排名前10的基因。整合三种算法的结果，维恩图显示DHRS2、STX17和TIMM44是三种算法共同鉴定的核心Mito-RGs。这三个核心基因在GDM胎盘组织中的mRNA表达水平均显著高于对照组。受试者工作特征曲线（ROC）分析显示，这三个基因各自对GDM有一定的诊断性能，曲线下面积（AUC）分别为0.738（DHRS2）、0.649（STX17）和0.688（TIMM44）。基于这三个基因计算的复合Mito-RGs评分在GDM组中也显著升高，其AUC为0.725。相关性热图分析显示，Mito-RGs评分与体质指数（BMI）呈正相关。
基于Mito-RGs评分的列线图建立及GDM中免疫细胞浸润评估
单变量和多变量逻辑回归分析均表明，Mito-RGs评分是GDM风险的强独立预测因子。通过整合孕周、母亲年龄、BMI分类和Mito-RGs评分，构建了用于预测个体GDM风险的列线图。该列线图的ROC分析显示其具有良好的诊断性能，AUC为0.761。校准曲线显示预测风险概率与观察到的风险概率高度一致。决策曲线分析（DCA）表明，在较宽的风险阈值范围内，该列线图能提供显著的净临床收益。使用ImmuCellAI算法分析免疫细胞浸润差异发现，与对照组相比，GDM胎盘样本中树突状细胞（DCs）、巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞和CD8+T细胞的浸润显著增加，表明GDM患者存在胎盘免疫细胞组成的改变和免疫功能的异常激活。
在单细胞分辨率下验证核心Mito-RGs
对单细胞RNA-seq数据进行分析，在质量控制后，共鉴定出15个不同的细胞簇。UMAP图显示GDM和对照组样本的细胞群之间存在明显分离，表明细胞组成存在显著差异。通过标记基因和SingleR注释，确定了主要细胞类型，包括上皮细胞、内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、髓细胞、NK细胞、B细胞、常见髓系祖细胞（CMPs）和组织干细胞。定量分析表明，与对照组相比，GDM组中上皮细胞、巨噬细胞、NK细胞和B细胞的比例有升高趋势，而组织干细胞比例降低。特征图显示，DHRS2、STX17和TIMM44主要在上皮细胞、巨噬细胞、组织干细胞和NK细胞中表达。Mito-RGs评分图谱显示，该评分在上皮细胞、组织干细胞、NK细胞和巨噬细胞中富集程度较高。单细胞GSVA富集分析显示，上皮细胞中脂质代谢、糖酵解、氧化磷酸化和增殖通路显著激活。巨噬细胞则表现出凋亡、炎症反应和代谢通路的激活。NK细胞中与增殖相关的生物过程显著激活。单细胞GSEA进一步证实，糖酵解、氧化磷酸化、缺氧、凋亡和活性氧相关通路主要在上皮细胞中激活；而包括抗原加工和呈递、IL6-JAK-STAT3信号通路、炎症反应和TNF-α通过NF-κB的信号传导在内的多种炎症激活相关通路，则主要在巨噬细胞中富集。细胞间通讯网络分析强调了上皮细胞、巨噬细胞和单核细胞之间在GDM中存在强烈的相互作用。研究还识别出了关键的配体-受体通路，包括B细胞与其他细胞类型之间的TGFB1-TGFBR1/TGFBR2信号传导、上皮细胞与其他细胞之间的FN1-ITGA5/ITGB1信号传导，以及巨噬细胞与其他细胞类型之间的LAMA5-CD44信号传导。
在人类胎盘组织和GDM小鼠模型中验证核心Mito-RGs
研究共纳入了12名孕妇，分为GDM组和对照组。对收集的人类胎盘组织进行免疫组化分析发现，与对照组相比，GDM女性胎盘样本中DHRS2和STX17的表达显著上调，而TIMM44水平无显著差异。通过高脂饮食成功建立了GDM小鼠模型。体重监测显示，GDM小鼠体重持续高于对照组，至第6周时差异具有统计学意义。口服葡萄糖耐量试验结果显示，在葡萄糖给药后30、60、90和120分钟，GDM小鼠的血糖水平均显著高于对照组，而空腹血糖水平无显著差异。对小鼠胎盘组织的免疫组化分析进一步验证了核心Mito-RGs的上调。在GDM胎盘中，DHRS2和TIMM44的表达水平显著高于对照组，而STX17虽有上升趋势但未达到统计学显著性。
讨论
本研究的结果与之前的报告一致，证实了线粒体功能障碍是GDM胎盘的一个标志。功能富集分析揭示了这些基因主要参与氧化磷酸化、脂肪酸代谢和TCA循环等关键能量代谢通路。GSEA显示与线粒体结构和ATP生成相关的通路受到抑制，支持了GDM胎盘线粒体功能受损的观点。鉴定出的三个核心Mito-RGs（DHRS2、STX17和TIMM44）在GDM中发挥着重要作用。STX17在自噬特别是线粒体自噬中起关键作用。TIMM44是线粒体内膜转位酶复合物输入马达的关键部分，对线粒体蛋白质输入和组装至关重要。DHRS2对于维持氧化还原平衡和减轻氧化应激至关重要。在验证研究中，DHRS2在生物信息学、人类和小鼠数据中均一致上调，表明它可能是GDM的关键调控因子。人类和小鼠组织之间STX17和TIMM44表达的差异可能源于物种特异性调控、样本异质性或方法学限制。研究发现GDM胎盘组织中促炎免疫细胞显著增加，这与之前的报告一致，表明免疫过度激活参与了GDM的病理生理过程。单细胞RNA-seq分析进一步揭示了GDM胎盘中上皮细胞、巨噬细胞和NK细胞比例升高，组织干细胞比例显著降低的细胞组成变化。通路分析证实，在GDM胎盘的上皮细胞和组织干细胞中，与线粒体功能障碍相关的生物过程显著激活；而在巨噬细胞中，关键炎症通路被上调。这些结果表明，上皮细胞、组织干细胞和巨噬细胞中的线粒体功能障碍共同促成了GDM中促炎免疫微环境的形成。本研究的优势在于应用了多种机器学习算法，从大量候选基因中稳健地识别出核心Mito-RGs，并通过实验验证增强了结果的可靠性。此外，基于核心基因开发Mito-RGs评分并将其整合到包含临床变量的列线图中，显著提高了预测性能，为GDM的早期诊断和风险分层提供了有价值的工具。然而，本研究也存在一些局限性，包括样本量较小，单细胞RNA-seq分析的样本尤其有限；线粒体功能障碍与免疫微环境相互作用的确切分子机制尚未完全阐明；未在小鼠模型中通过流式细胞术等多重方法评估免疫细胞浸润；以及Mito-RGs评分在无创诊断中的潜在应用尚未探索。未来的研究需要在更大的队列中进行验证，并通过体内外实验阐明核心基因的具体功能机制。
结论
总而言之，本研究强调了线粒体功能障碍和免疫失调对GDM发病机制的重要贡献。核心Mito-RGs（DHRS2、STX17和TIMM44）的鉴定以及基于Mito-RGs评分的风险预测工具的开发，凸显了其潜在的诊断价值和临床实用性。这些发现为未来GDM的临床转化和精准医学方法提供了宝贵的见解和坚实的基础。
