《Frontiers in Endocrinology》：Plasma ceramide Cer24:0 and insulin resistance: associations with TyG and TG/HDL-C in a multicenter study of coronary artery disease cohorts
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本综述聚焦于血浆神经酰胺，尤其是Cer24:0，与胰岛素抵抗（IR）指标（如TyG指数和TG/HDL-C比值）在冠状动脉疾病（CAD）患者中的关联。研究表明，Cer24:0水平升高与脂质核心的IR显著相关，混合图模型（MGM）分析揭示了其与TyG的直接条件关联。作者开发了一个包含Cer24:0的机器学习预测模型，其对临床IR（定义为TyG ≥ 9）具有中等的辨别能力（ROC–AUC: 0.770）。文章指出，尽管是观察性研究，但结果提示循环神经酰胺谱，特别是Cer24:0，可能有助于完善CAD患者的代谢风险分层。
1 引言
冠状动脉疾病（CAD）仍然是全球主要的死亡原因之一。传统风险因素固然重要，但代谢失调，特别是胰岛素抵抗（IR）的作用日益凸显，被认为是动脉粥样硬化进展和不良心血管事件发生的关键驱动因素。生物活性脂质网络，尤其是神经酰胺，被认为在IR与CAD的关系中发挥着关键的桥梁作用，可能作为近端生物标志物并参与关键的病理过程。
尽管有越来越多的证据将神经酰胺与IR和CAD联系起来，但神经酰胺的生物学效应表现出阶段依赖性和背景变异性。这意味着神经酰胺可能在疾病进展的不同阶段扮演不同角色，强调需要进行纵向研究来阐明其与近端信号和下游效应的动态相互作用。在IR评估方面，高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术是金标准，但其高昂的成本和操作复杂性限制了其常规临床应用。因此，基于标准实验室检查的替代指数，如甘油三酯-葡萄糖指数（TyG）、胰岛素抵抗代谢评分（METS-IR）和甘油三酯/高密度脂蛋白胆固醇比值（TG/HDL-C），已成为预测代谢风险和心血管事件的实用工具。
然而，神经酰胺在代谢中的作用具有双向性和背景依赖性。一方面，Cer24:0通常与IR指标呈正相关，暗示其可能作为代谢异常的信号分子；另一方面，在CAD患者中，较高的Cer24:0水平与更好的预后相关，这表明同一分子在下游结局阶段可能参与不同的生物途径，甚至具有潜在的保护性信号。这种悖论凸显了神经酰胺脂质组在风险分层中承载的双向信息，需要通过纵向研究和多结局分析来澄清。鉴于此，本研究旨在探讨神经酰胺谱与替代IR指标之间的关联，并评估它们在CAD患者中识别IR的潜在价值。
2 方法
2.1 研究设计与参与者
本研究是一项前瞻性、多中心、观察性研究，于2021年4月1日至2022年8月31日期间在北京安贞医院和邯郸市第一医院进行。研究人群由年龄≥18岁、疑似CAD并计划进行冠状动脉成像的成年人组成，不论性别或种族。关键的排除标准包括非冠状动脉性心脏病、疑似主动脉缩窄或急性肺栓塞、家族性高胆固醇血症、药物滥用或酒精依赖、既往3个月内发生脑血管意外或重大心脏介入手术等。
2.2 胰岛素抵抗评估
IR通过三个经过验证的替代指数进行量化：TyG指数、METS-IR和TG/HDL-C比值。具体计算公式分别为：
TyG = ln[TG(mg/dL) × FBG(mg/dL) / 2]；
METS-IR = ln[2 × FBG(mg/dL) + TG(mg/dL)] × BMI / ln[HDL-C(mg/dL)]；
TG/HDL-C = TG(mg/dL) / HDL-C(mg/dL)。
2.3 神经酰胺定量及选择依据
通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对四种神经酰胺物种（Cer16:0、Cer18:0、Cer24:0和Cer24:1）进行定量。选择这四种神经酰胺的依据在于：它们构成了血浆中超过80%的循环神经酰胺；它们具有不同的生物合成起源（分别由CerS6、CerS1、CerS2合成），可能反映不同的代谢途径和生物学功能；大量证据表明Cer16:0和Cer18:0与较高的心血管风险和胰岛素抵抗相关，而Cer24:0可能具有中性或保护作用。
2.4 关联性分析
使用Spearman秩相关评估神经酰胺与IR指数的成对关联。应用混合图模型（MGM）探索IR指数、神经酰胺物种和传统代谢变量之间的条件独立性，构建一个稀疏网络，其中边代表控制所有其他变量后的非零偏相关系数。使用限制性立方样条回归（RCS）检查神经酰胺浓度与IR指数之间潜在的非线性剂量-反应关系。
2.5 通过双重机器学习进行因果效应估计和敏感性分析
使用双重机器学习（DML）与因果森林估计器，在调整已测混杂因素后，估计自然对数转换的神经酰胺浓度对IR的平均部分效应。为了评估未测量混杂因素对主要估计值的潜在影响，进行了基于Cinelli框架的敏感性分析，报告了稳健性值（RV）。其中，RV(θ)反映了未测量混杂因素必须同时与治疗和结果变量具有的最小关联强度，才能将点估计值θ推至零值。
2.6 机器学习建模
本研究实施了六种机器学习算法来预测IR的替代指数。通过网格搜索策略结合五折交叉验证进行超参数优化。为了评估在表现出最佳预测性能的机器学习模型中的整体特征重要性，采用了SHAP值。
2.7 统计分析
基线数据根据分布情况以均值±标准差或中位数（四分位距）表示。使用ROC曲线下面积（ROC-AUC）和精确率-召回率曲线下面积（PR-AUC）评估模型的区分能力。使用净重新分类改善指数（NRI）评估将神经酰胺物种整合到基线模型中所带来的预测能力的统计和临床提升。
3 结果
3.1 受试者特征
队列包括987名参与者，中位年龄65.1岁，69%为男性。参与者略超重，中位身体质量指数（BMI）为24.6 kg/m2，心血管代谢疾病患病率显著：61%患有高血压，30.6%患有糖尿病，8.4%患有明确的脑血管疾病。IR指数（包括空腹血糖水平、TyG、TG/HDL-C和METS-IR）轻度升高。
3.2 关联性分析
3.2.1 Spearman相关性分析
Spearman分析发现循环神经酰胺物种与IR的替代标志物之间存在显著且主要为正相关的关联。在个体神经酰胺物种中，Cer24:0与TyG的关联最强。Cer18:0和Cer24:1也与TyG和TG/HDL-C相关。相比之下，Cer16:0与IR标志物的关联较弱。
3.2.2 MGM分析
MGM构建了一个包含四种血浆神经酰胺物种、三种IR替代指数和常规代谢变量的条件依赖网络。在调整了多个变量并采用偏相关技术后，神经酰胺物种与IR替代指标之间的关联根据链长和饱和度而不同。具体而言，Cer24:0与TyG呈正相关（偏r = 0.23；95% CI，0.17至0.29）。相比之下，Cer18:0和Cer24:1的关联相对较弱，而Cer16:0未观察到关联。关于TG/HDL-C也观察到类似模式，其中Cer24:0表现出中等程度的正相关。网络分析未发现神经酰胺亚种与METS-IR之间存在直接的条件依赖关系。
3.3 RCS回归分析
RCS回归分析显示了循环神经酰胺物种与各种IR指数之间的浓度依赖性关联。在校正了年龄、性别、BMI和其他预定协变量后，Cer16:0、Cer18:0、Cer24:0和Cer24:1继续与TyG表现出显著关联。Cer16:0和Cer24:1存在非线性关系。在神经酰胺物种与TG/HDL-C以及METS-IR之间也发现了类似的浓度依赖性关联。
3.4 具有敏感性分析的DML因果效应估计
使用正交机器学习框架和协变量调整，估计了代谢暴露对IR的平均部分效应。TyG在ln(Cer24:0)每增加1个单位时表现出统计学上显著的正向调整后关联（估计值0.459；95% CI，0.252至0.665；P = 0.001）。TG/HDL-C也显示出显著的正向调整后关联。相比之下，METS-IR的调整后关联不具有统计学意义。针对未测量混杂因素的敏感性分析表明，TyG和TG/HDL-C具有中等的稳健性值，而METS-IR的稳健性值极小。
3.5 SHAP分析
SHAP分析用于评估个体神经酰胺物种的相对贡献。SHAP汇总图显示，Cer24:0浓度的升高（由右侧的红点表示）与正的SHAP值相关，表明该物种对预测的TyG分数产生了最显著的向上影响。除Cer16:0外，所有物种的SHAP值均随着血清浓度的增加而近似单调增加。对于TG/HDL-C和METS-IR也观察到了类似的浓度依赖性模式。
3.6 基于神经酰胺的IR预测模型开发
IR使用TyG阈值≥9作为分类标准。通过LASSO回归从所有候选变量中筛选出七个变量纳入最终预测模型。在测试的所有模型中，采用二项分布和logit链接函数并包含岭正则化的广义线性模型（GLM）表现出最佳的预测性能。ROC分析表明该GLM具有显著的区分能力，ROC-AUC为0.770（95%CI，0.741至0.799）。校准评估显示预测事件概率与观察事件概率高度一致。在F1最优阈值0.377处，总体分类错误率为30.7%。通过五折交叉验证进行的内部验证证实了模型的稳健性能。为了评估神经酰胺提供的额外预测价值，我们比较了包含所有七个LASSO选择变量（包括神经酰胺）的完整GLM与仅包含四个非神经酰胺LASSO选择变量的基线GLM。基线模型的ROC-AUC为0.713（95%CI：0.690至0.751）。将神经酰胺变量纳入完整模型后，产生了具有统计学意义的总体无类别NRI为0.54（95% CI：0.42至0.66）。
4 讨论
在这项涉及987名接受冠状动脉造影的中国CAD成年人的多中心横断面研究中，发现特定的神经酰胺物种（尤其是Cer24:0）的血浆浓度升高与IR增加相关。这些关联在多变量调整后仍保持统计学显著性。在MGM中，Cer24:0与TyG表现出直接的条件关系。RCS分析支持浓度-反应关系，表明Cer24:0的关联近似线性，而其他神经酰胺物种则表现出非线性证据。总的来说，这些发现表明，分析神经酰胺谱——尤其是Cer24:0——可能为理解IR提供补充性见解。
鉴于目前缺乏普遍接受的诊断CAD人群IR的金标准，本研究操作性地将临床胰岛素抵抗定义为TyG ≥ 9.0。神经酰胺是一类鞘脂，与胰岛素抵抗和2型糖尿病的发病机制有关。各种循环神经酰胺物种与不良代谢结局相关，其中长链饱和神经酰胺（Cer16:0， Cer18:0）的证据最为有力。然而，某些极长链物种（Cer24:0）也在代谢失调中发挥作用。
我们基于人群的分析表明，Cer24:0水平与IR负担（通过TyG和TG/HDL-C比值指示）之间存在一致的正相关。这些发现暗示了一种阶段依赖性现象：在我们的CAD队列中，升高的Cer24:0水平与不良的IR表型相关。然而，基于事件的研究一致表明，相对较低的Cer24:0水平（反映为较高的Cer16:0/Cer24:0或Cer18:0/Cer24:0比值）预示着较差的心血管结局，这表明在疾病进展的不同阶段可能具有不同的生物学作用。我们提出，在早期代谢失调期间，增加的Cer24:0浓度可能作为一种“应激信号”，指示脂质核心IR的开始。相比之下，在疾病后期和更晚期阶段，Cer24:0水平的相对下降可能标志着晚期代谢和心血管代偿失调。这种阶段依赖性的改变可能归因于几种机制。
我们观察到Cer24:0与TyG和TG/HDL-C之间存在显著的正相关，但与METS-IR无关。这些发现提示神经酰胺在脂质核心代谢功能障碍中具有更特异的生物学作用。Cer24:0是一种极长链神经酰胺，通过涉及饱和脂肪酸的从头途径合成，涉及丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）和神经酰胺合酶2（CerS2）的作用。在甘油三酯升高和葡萄糖代谢失调的条件下，Cer24:0倾向于积累，如TyG水平升高所示。从机制上讲，Cer24:0可能抑制Akt依赖的胰岛素信号传导，通过激活甾醇调节元件结合蛋白（SREBP）促进甘油三酯储存，并且与降低HDL-C介导的保护有关。这为神经酰胺积累与以TyG和TG/HDL-C为代表的脂质核心失调之间的联系建立了机制基础。相比之下，METS-IR包含了BMI作为变量，提供了超越单纯脂质介导机制的更全面的评估。因此，Cer24:0与TyG和TG/HDL-C之间的差异关联，与神经酰胺诱导的脂毒性和脂质核心胰岛素抵抗之间的紧密生物学联系是一致的。同时，METS-IR更广泛的代谢框架可能解释了在此背景下观察到的直接关联减弱。
SHAP分析表明，Cer24:0浓度升高与预测的TyG值增加相关，这通过正的SHAP值得到证明，突显了其对预测模型的重要贡献。这些发现在方向上与MGM中观察到的Cer24:0与TyG之间的直接条件关联一致。值得注意的是，DML估计证实了这些结果，显示了沿TyG和TG/HDL-C轴的正向平均关联，而METS-IR则未显示出统计学上显著的调整后关联。总的来说，这些互补的方法论——侧重于预测贡献（SHAP）、条件关联（MGM）以及在明确假设下的平均调整后关联（DML）——呈现出一致的模式，支持了以Cer24:0为核心的脂质中心胰岛素抵抗轴。
在MGM分析中，我们确定了Cer24:0与TyG之间的偏相关系数为0.23。尽管这种标准化关联表现出中等的统计强度，但观察到的Cer24:0水平变化（可能影响TyG）强调了Cer24:0在临床评估中的潜在意义。具体来说，DML模型估计的Cer24:0对TyG的平均部分效应（APE）为0.459，这表明Cer24:0的自然对数每增加一个单位，平均与TyG增加0.459个单位相关。因此，Cer24:0浓度从第25百分位数（1400 ng/mL）改变到第75百分位数（2270 ng/mL）可能导致预测的TyG增加约0.22个单位。
这种数值差异具有潜在的临床意义，因为它可能阐明Cer24:0水平的变化如何改变患者在既定临床风险阈值上的代谢风险分类。例如，我们研究队列中TyG的中位数为8.9，通常表明患者处于中等代谢风险。与升高的Cer24:0水平潜在相关的独立增加约0.22个单位，可能将这些患者的TyG提升至约9.12。重要的是，这个预测的TyG值与大型冠状动脉疾病队列研究中确定的高风险阈值密切吻合。这些阈值通常与主要不良心血管事件风险的显著增加相关。“临界点”现象意味着Cer24:0水平可以作为一个辅助生物标志物，用于增强识别可能受益于强化干预策略的具有显著代谢风险的个体。
除了在提示个体患者风险方面的潜在应用外，我们预测模型的结果为这种生物标志物在人群水平上的附加价值提供了定量证据。模型的ROC-AUC从基线模型的0.71增加到包含神经酰胺后的0.77。此外，NRI显示，纳入神经酰胺变量产生了具有统计学意义的总体无类别NRI为0.54。临床上，这些发现表明，Cer24:0谱分析可能会提高IR表型分类的精确度。
本研究有几个局限性值得考虑。首先，由于其横断面设计，我们无法确定神经酰胺水平与IR状态之间的时间序列。这本质上限制了我们推断因果关系的能力，反向因果关系和残留混杂不能完全排除。其次，IR是使用替代指数而非金标准的高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术进行评估的。虽然这些替代指标经过广泛验证且实用，但可能导致IR的错误分类，并且它们的构建覆盖范围可能不同。第三，本研究中使用的神经酰胺谱仅限于四种最普遍且经过临床验证的血浆物种。采用更广泛的鞘脂组学分析方法，包括二氢神经酰胺和神经酰胺比值，可以增强机制理解并提高预测准确性。第四，尽管本研究采用了多变量和基于网络的方法论，但残留混杂是一个显著的局限性。具体来说，几个关键的混杂变量，包括药物使用（如他汀类药物和抗糖尿病药物如胰岛素、二甲双胍和SGLT2抑制剂）、饮食模式和内脏肥胖，未在分析中得到充分测量或调整。最后，本研究仅针对接受冠状动脉评估的中国CAD患者进行。因此，研究结果可能不适用于非CAD人群、其他种族背景的个体，或一级预防背景。因此，需要在不同队列中进行验证以确立更广泛的普适性。
5 结论
特定神经酰胺，尤其是Cer24:0，的浓度升高与通过常用替代标志物评估的IR显著相关。利用MGM的分析揭示了Cer24:0与TyG之间的直接条件关联。SHAP分析表明，在预测作为IR替代标志物的TyG的模型中，Cer24:0在神经酰胺分子中表现出最高的边际重要性。基于神经酰胺的预测模型在识别IR（定义为TyG≥9）方面表现出中等准确性。这些发现表明，评估神经酰胺谱，特别是Cer24:0，可能会增强对CAD患者代谢风险的理解。
