《Frontiers in Immunology》：Integrative multi-omics and machine learning reveals the spatial niche distribution and role of CYP27A1+TAMs in immunotherapy response in non-small cell lung cancer
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本研究整合单细胞与空间转录组学，运用ISCHIA算法构建了NSCLC的九个空间生态位，揭示了富含效应细胞且仅存于ICB应答者中的生态位9。其中，以高表达CYP27A1为特征的肿瘤相关巨噬细胞（CYP27A1+TAMs）是关键组分，它通过抗原呈递和趋化因子分泌招募CD8+T细胞，从而改善患者预后。此外，ICB治疗激活了该亚群的LXR通路并增强其抗凋亡能力。此研究强调了空间生态位在解析肿瘤免疫微环境（TIME）和预测免疫检查点阻断（ICB）疗效中的重要性，为探索NSCLC个性化治疗的潜在生物标志物提供了新方向。
单细胞与空间转录组学样本制备与整合
研究整合了来自同一批非小细胞肺癌（NSCLC）患者的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据和空间转录组学（ST）数据。单细胞数据集包含19个样本，空间转录组数据集包含15个术后样本，涵盖了肿瘤核心、浸润性肿瘤以及不同病理应答状态的间质区域。通过严格的质控、批次效应校正和聚类分析，成功注释了包括上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、髓系细胞、T细胞、B细胞、浆细胞等在内的主要细胞群。髓系细胞中的巨噬细胞被进一步细分为五个亚群：CCL4L2+TAMs、CYP27A1+TAMs、FGL2+TAMs、LPL+TAMs和SPP1+TAMs。利用Robust Cell Type Decomposition (RCTD) 方法，将单细胞数据作为参考，对空间转录组斑点进行细胞类型解卷积，成功重建了高分辨率的空间细胞图谱，为后续深入分析肿瘤免疫微环境（TIME）奠定了基础。
空间生态位分析揭示免疫治疗后的肺癌微环境景观
为了从细胞群落的角度理解TIME，研究使用ISCHIA（Identifying Spatial Co?occurrence in Healthy and InflAmed tissues）算法对空间斑点进行生态位分析，共识别出9个不同的空间生态位，称为组成簇（Composition Cluster, CC1-CC9）。根据主要细胞类型、空间分布倾向和通路活性，这些生态位被归类为四类：肿瘤富集生态位（CC2, CC4, CC6）、肿瘤-间质生态位（CC7, CC8）、正常上皮富集生态位（CC5）以及免疫-间质生态位（CC1, CC3, CC9）。PROGENy通路富集分析显示，不同生态位具有 distinct 的功能状态。值得注意的是，生态位9（CC9）富含效应细胞，且仅存在于对免疫检查点阻断（ICB）治疗有应答的患者样本中。相反，生态位4（CC4）和生态位6（CC6）作为肿瘤浸润前沿的生态位，富含SPP1+TAMs、调节性T细胞（Tregs）和肌成纤维样癌症相关成纤维细胞（myCAFs）等免疫抑制细胞，呈现出免疫排斥的景观。这种基于空间生态位的量化分析，为比较不同治疗响应下TIME的异质性提供了一个可比较的基础单元。
空间轨迹与相互作用分析揭示浸润性肿瘤的生物学行为
聚焦于肿瘤富集生态位，研究发现CC2是恶性细胞比例最高的生态位，呈现出典型的“免疫荒漠”状态，严格存在于肿瘤核心。而位于肿瘤边缘的CC4和CC6则是肿瘤浸润的关键区域。细胞通讯分析（使用CellChat工具）表明，在CC4和CC6内部，细胞间相互作用主要促进肿瘤迁移和细胞外基质（ECM）重塑。例如，VEGF、COMP、ANGPTL2、CEACAM6等配体介导的相互作用促进了血管生成并抑制免疫反应；胶原-整合素信号通路和以SDC1（Syndecan-1）为中心的相互作用网络则加剧了纤维化，为肿瘤浸润创造了物理屏障。通过SPATA2构建的从CC2经CC6到CC4的空间轨迹分析显示，沿此轨迹，基因表达和通路活性发生连续变化：CC2高表达与增殖相关的MYC靶标和氧化磷酸化通路；CC4则特异性上调上皮-间质转化（EMT）、血管生成等与浸润相关的通路。关键基因如SDC1、ITGA2在肿瘤区域高表达，而COMP特异性地分布于肿瘤边缘，并在空间上与CC4共定位，提示COMP-SDC1等相互作用可能在肿瘤浸润中扮演关键角色。
CYP27A1+TAMs与CD8+T细胞共定位是免疫治疗成功的关键因素
对比不同治疗响应组，研究发现富含效应细胞的生态位9（CC9）在应答者中显著富集。深入分析CC9的细胞组成发现，其相较于其他免疫-间质生态位（如CC1）含有更高比例的CD8+T细胞。相关性分析进一步指出，CYP27A1+TAMs与细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性呈最强正相关。在单细胞水平上，CYP27A1+TAMs在免疫治疗应答者（MPR）中的比例显著高于非主要病理应答者（NMPR）。功能分析显示，尽管CYP27A1+TAMs不表达传统的M1型巨噬细胞标志物，但其抗原呈递相关通路（如MHC-I和MHC-II）的活性在所有巨噬细胞亚群中最高。生存分析表明，无论在TCGA-LUAD队列中高表达CYP27A1基因，还是具有高的CYP27A1+TAMs特征评分，均与患者更好的总生存期（OS）显著相关。细胞通讯和空间共定位分析为这一关联提供了机制解释：CYP27A1+TAMs通过MHC-I/II通路与CD8+T细胞进行抗原呈递相互作用，并高表达趋化因子配体-受体对CXCL9-CXCR3。空间分析（使用Ripley‘s K函数和MISTY）证实，CYP27A1+TAMs与CD8+T细胞在空间上存在显著的共定位倾向，且这种共定位广泛存在于各个样本中。此外，CYP27A1+TAMs还通过CD86信号通路广泛激活CD8+T和CD4+T细胞（而非Tregs）。这些结果共同表明，CYP27A1+TAMs通过多途径招募和激活CD8+T细胞，是其发挥抗肿瘤作用的核心机制。
免疫治疗通过上调LXR增强CYP27A1+TAMs的功能
为了探究免疫治疗对CYP27A1+TAMs的调控作用，研究比较了治疗前后该细胞亚群的基因表达和通路变化。结果显示，治疗后CYP27A1+TAMs的抗原呈递能力并未进一步提升，但其抗凋亡相关通路被激活，且胆固醇代谢关键酶CYP27A1、肝X受体（Liver X Receptor， LXR， 由NR1H2和NR1H3编码）及其下游靶基因（如ABCG1， ABCA1）的表达显著上调。根据LXR表达水平，将CYP27A1+TAMs进一步分为LXR高表达（TAMs-LXRhi）和LXR低表达（TAMs-LXRlow）两组。空间分布分析发现，TAMs-LXRhi在肿瘤样本中的丰度显著高于TAMs-LXRlow，并且在间质样本中，TAMs-LXRhi与CD8+T细胞的共定位更强。MISTY分析及队列相关性分析均证实，TAMs-LXRhi与CD8+T细胞的空间关联性和相关性显著强于TAMs-LXRlow。此外，经典LXR靶基因APOE等与CD8+T细胞标志物在TCGA队列中呈正相关。这些发现表明，免疫治疗后，CYP27A1+TAMs的LXR通路被激活，使其进入一个生存能力更强、招募CD8+T细胞能力更佳的“高功能”状态。
外部队列验证
研究的发现在多个独立的外部数据集中得到了验证。在单细胞数据集GSE131907和GSE223203中，确认了CYP27A1在肺组织巨噬细胞中的特异性高表达，且CYP27A1表达水平高的巨噬细胞显示出最强的抗原呈递能力和偏向β-氧化的代谢特征。利用这些单细胞数据对空间转录组数据集（E-MTAB-13530和GSE267960）进行解卷积和注释后，空间分析再次证实了CYP27A1表达与CD8+T细胞标志物在空间上的紧密关联。此外，人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）的数据显示，CYP27A1在肺和胰腺的巨噬细胞中特异性高表达，且其所在的巨噬细胞功能簇（Cluster 58）的基因特征与本研究中的CYP27A1+TAMs高度相似，进一步佐证了该细胞亚群身份的稳定性及其在先天免疫应答和脂质代谢中的关键作用。
基于CYP27A1+巨噬细胞风险评分（CMRS）预后模型的构建与独立验证
基于上述发现，研究旨在构建一个可用于临床预后预测的模型。通过筛选TCGA-LUAD队列中肿瘤与正常组织的差异表达基因以及CYP27A1+TAMs的标志基因，取其交集获得108个候选基因。经过单变量Cox回归分析，筛选出24个与预后显著相关的基因。随后，通过系统评估101种不同的机器学习算法组合，最终选择在多个验证队列中平均C-index最高的Elastic Net（alpha=0.9）算法，构建了CYP27A1+巨噬细胞风险评分（CMRS）模型。该模型包含7个保护性基因。在训练集（TCGA-LUAD）和多个独立验证集（GSE13213, GSE31210, GSE42127, GSE50081及其合并的Meta队列）中，CMRS模型均表现出稳健的预后预测性能。KM生存分析显示，根据CMRS中位数划分的低风险组患者，其总生存期显著优于高风险组。时间依赖性ROC曲线证实了模型在1年、3年和5年生存率预测上的准确性。与已发表的多个预后模型相比，CMRS在大多数队列中取得了更高的C-index，展现了其优越的预测效能和临床转化潜力。
