《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Cell type-dependent suppression of the RNA helicase DDX3Y levels by the close paralog DDX3X
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本文综述了DEAD-box RNA解旋酶DDX3X对其Y染色体旁系同源物DDX3Y表达的复杂调控机制。研究表明，DDX3X的缺失会在不同细胞系（HCT116和U87MG）中通过不同的分子途径（mRNA稳定性和蛋白质降解）上调DDX3Y水平，以确保总DDX3活性的稳态。这种细胞类型特异性的交叉调控，为理解DDX3X相关疾病（如DDX3X综合征、伯基特淋巴瘤）中出现的性别二态性提供了新的分子解释。
细胞类型依赖性的RNA解旋酶DDX3X对其紧密旁系同源物DDX3Y水平的抑制作用
摘要
DEAD-box RNA解旋酶DDX3X在发育和疾病中扮演重要角色。在诸如肿瘤发生等发育和病理过程中，DDX3X的缺失可能导致雄性个体中其紧密旁系同源物DDX3Y的代偿性上调，这或许是一些与DDX3X相关疾病表现出性别二态性的基础。然而，DDX3X如何交叉调控DDX3Y在很大程度上仍是未知数。本研究在两种雄性来源的人类癌细胞系HCT116和U87MG中，探究了DDX3X对DDX3Y的调控。在HCT116细胞中敲低DDX3X会导致DDX3Y的mRNA和蛋白水平适度增加，部分原因是DDX3Y转录本的稳定性增强。相反，在U87MG细胞中降低DDX3X会显著上调DDX3Y蛋白水平，但不影响其mRNA，这主要是通过增强DDX3Y的蛋白质稳定性实现的。我们进一步证明DDX3X与DDX3Y存在物理相互作用。在U87MG细胞中，DDX3Y的稳定性远低于DDX3X，将DDX3Y中的两个赖氨酸残基替换为DDX3X中对应的精氨酸可以稳定DDX3Y。因此，DDX3X缺失后DDX3Y的代偿性上调可以发生在转录本或蛋白质水平，这表明这对X和Y染色体连锁的旁系同源物之间存在着复杂且细胞类型特异性的交叉调控，以维持总DDX3剂量的稳定。
引言
DEAD-box RNA解旋酶DDX3在RNA代谢的几乎所有方面都发挥作用，包括转录、剪接、核输出、降解、翻译和应激反应。人类基因组包含两个功能性的DDX3同源物，即X染色体连锁的DDX3X和Y染色体连锁的DDX3Y，它们被认为是从一个常染色体基因进化而来。DDX3X被广泛转录和翻译，并与多种疾病相关，如出生缺陷、病毒感染、炎症和癌症。特别是，DDX3X的突变会导致DDX3X综合征，这是一种神经发育障碍，并伴有其他组织（包括神经嵴来源的组织）的缺陷。DDX3X既可作为癌基因也可作为肿瘤抑制因子，高DDX3X表达可作为阳性或阴性预后因子，具体取决于癌症类型。相比之下，虽然DDX3Y在大多数组织中也活跃转录，但其蛋白质在男性生殖系统外通常检测不到，这可能是由于转录后调控（如翻译抑制）所致。DDX3Y的缺失与仅支持细胞综合征（一种严重的睾丸缺陷）有关。
DDX3X和3Y的蛋白质序列具有约91%的同一性，并且在蛋白质合成功能上可以互换，尽管有报道称它们在应激颗粒形成和翻译抑制方面存在差异。有趣的是，细胞对总DDX3剂量特别敏感，一个旁系同源物的扰动会导致另一个旁系同源物在培养细胞中产生相反的反应。DDX3X的缺失也被证明会在体内引起DDX3Y的代偿性上调。例如，在神经祖细胞中条件性敲除Ddx3x会导致纯合雌性小鼠出现严重的脑部缺陷，但半合子雄性小鼠则头部大小正常，且Ddx3y mRNA适度增加。DDX3X突变已在各种类型的淋巴瘤中检测到，包括约30%的伯基特淋巴瘤病例，该病的男女发病率比为3:1。DDX3X功能缺失通过调节全局蛋白质合成和缓冲MYC诱导的蛋白质毒性应激来阻止MYC癌基因驱动的淋巴瘤发生，但已建立的雄性淋巴瘤细胞可以通过异常上调DDX3Y蛋白水平来克服这种效应。令人惊讶的是，这种上调并不伴随DDX3Y mRNA丰度的改变，并且没有证据表明DDX3X可以直接控制DDX3Y的翻译，这就提出了如何实现这种交叉调控的问题。为了理解DDX3X如何调节DDX3Y水平，我们在人类雄性来源的HCT116和U87MG细胞系中进行了DDX3X的功能缺失研究。我们的结果表明，DDX3X可以在细胞类型依赖性方式下，在mRNA或蛋白质水平上抑制DDX3Y，这为调和文献中的分歧提供了可能的解释。
材料与方法
试剂
人类DDX3X和DDX3Y的全长cDNA克隆购自GE-Dharmacon，并亚克隆到带有C末端HA或FLAG标签的pCS2+表达载体中。使用放线菌素D进行转录的药理学抑制。本研究中使用的一抗包括小鼠抗DDX3X、兔抗DDX3X、兔抗HA、兔抗GFP和定制兔DDX3Y抗体。二抗包括HRP偶联的小鼠抗β-肌动蛋白、HRP偶联的马抗小鼠IgG和HRP偶联的山羊抗兔IgG。
细胞培养与转染
U87MG细胞在补充了10%胎牛血清的MEM培养基中培养。HCT116细胞在补充了10%胎牛血清的McCoy's 5A培养基中培养。细胞在50%汇合度时使用Lipofectamine RNAiMAX转染DDX3X、DDX3Y或对照siRNA，或在70%汇合度时使用Lipofectamine 3000转染质粒。对于同时使用siRNA和质粒的实验，先转染siRNA 24小时，然后再转染质粒48小时。
CRISPR/Cas9介导的基因组编辑
使用CRISPRscan设计靶向DDX3X基因外显子5或外显子1的小向导RNA。将原型间隔序列DDX3X-g1和DDX3X-g2克隆到pSpCas9(BB)-2A-GFP/PX458表达载体中。将质粒以500 ng/mL的浓度转染U87MG细胞48小时，然后通过荧光激活细胞分选分选表达GFP的细胞，并单独铺板到96孔板中。克隆在补充了20%胎牛血清的MEM培养基中培养2-3个月，以收集足够样品用于后续程序。分离基因组DNA，然后使用基因分型引物进行PCR扩增，随后进行PCR克隆和桑格测序。使用RNeasy Mini Kit分离总RNA，然后使用iScript cDNA合成试剂盒进行逆转录合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增，随后再次进行PCR克隆和桑格测序。
蛋白质印迹和RT-qPCR分析
将细胞在冰上用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解，并按所述进行蛋白质印迹。免疫沉淀使用Pierce抗HA琼脂糖在4°C下过夜进行，结合的蛋白通过在95°C的Laemmli SDS样品缓冲液中煮沸10分钟释放。使用HRP偶联的抗体和Clarity Western ECL底物在Bio-Rad ChemiDoc touch成像仪上检测印迹。使用RNeasy Mini Kit从收集的胚胎中提取总RNA，然后使用iScript cDNA合成试剂盒将其逆转录为cDNA。使用qMax Green qPCR Mix，在Quant Studio 6 Flex实时PCR系统上进行定量PCR。
结果
DDX3X的缺失上调HCT116细胞中的DDX3Y mRNA和蛋白
先前的研究表明，在小鼠中敲除Ddx3x会导致Ddx3y mRNA上调。然而，由于缺乏能够区分Ddx3x和3y的抗体，翻译的Ddx3y蛋白如何受到影响仍不清楚。利用最近生成的能特异性识别人DDX3Y而非3X的抗体，我们能够使用培养的人细胞系来检测DDX3X对DDX3Y蛋白的调控。在HCT116结肠癌细胞中，我们检测到在siRNA介导的DDX3X敲低后，内源性DDX3Y增加了44%。这伴随着DDX3Y mRNA增加了98%，表明DDX3Y蛋白的上调主要是由转录本水平升高引起的。蛋白质变化小于mRNA变化可能反映了在翻译或翻译后水平存在额外的负反馈。由于DDX3X已被证明在RNA代谢的各个过程中发挥作用，包括转录、核输出和稳定性，我们评估了DDX3Y mRNA的稳定性是否会被DDX3X改变。在用转录抑制剂放线菌素D处理细胞后，我们测量了DDX3Y mRNA随时间的变化量。敲低DDX3X后，DDX3Y mRNA降解更慢，半衰期为4.3小时，而对照组的半衰期为3.0小时。此外，在用放线菌素D处理8小时后，对照组和DDX3X敲低细胞之间DDX3Y mRNA的倍数变化存在显著差异，这意味着DDX3X会去稳定DDX3Y mRNA。然而，我们不能排除DDX3X也抑制DDX3Y转录的可能性。
CRISPR/Cas9在DDX3X位点引入的缺失导致U87MG细胞中DDX3X蛋白表达降低但未被消除
我们接下来转向了胶质瘤细胞系U87MG。为了敲除这些细胞中的DDX3X，我们分别使用两个向导RNA进行CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，并用每个gRNA获得了一个克隆。由于DDX3X和3Y的cDNA序列高度同源，两个gRNA都被设计为与DDX3Y存在错配，因此不太可能靶向这个旁系同源物。对基因组DNA和cDNA的测序表明，克隆1含有整个外显子5的159-bp框内缺失，这导致了一个较小的DDX3X蛋白，缺失了残基96-148。相比之下，克隆2有一个14-bp的缺失，这通过DDX3X cDNA的测序得到确认。虽然我们最初使用Bethyl抗DDX3X抗体进行的蛋白质印迹表明，在克隆2中DDX3X被完全敲除，但来自Santa Cruz的另一种抗体检测到了一个大小与DDX3X相似但强度显著降低的条带。我们最初怀疑这个条带代表DDX3Y，因为这两个旁系同源物具有高度的序列同源性。然而，使用DDX3Y特异性抗体进行的蛋白质印迹未能获得任何信号，并且无论亲本细胞还是克隆2中DDX3Y的RT-qPCR扩增曲线在40个循环内均未达到平台期，这表明DDX3Y表达可能在这些细胞中被永久沉默。此外，当细胞转染靶向DDX3X而非DDX3Y的siRNA时，该条带减少，表明它代表DDX3X。对DDX3X cDNA的仔细重新检查显示，细胞可能在缺失后利用了一个稍下游且原本不在阅读框内的AUG来恢复开放阅读框，从而保留了大部分DDX3X蛋白序列和可能的功能。这表明存在对抗DDX3X功能丧失的选择压力。事实上，在DepMap门户网站上的搜索确实推断出DDX3X缺失对U87MG细胞有负面影响。克隆2中较低的内源性DDX3X蛋白水平可能是由于上游AUG的翻译抑制所致，该AUG是该克隆中变得不在阅读框内的原始起始密码子。类似的、由上游AUG引起的自然发生的翻译抑制在DDX3Y中已有报道。
DDX3X促进U87MG细胞中DDX3Y蛋白的周转
由于在克隆2或亲本U87MG细胞中使用特异性抗体均未检测到内源性DDX3Y，我们向这些细胞转染了编码C末端HA标签的DDX3Y的质粒。使用抗HA抗体进行的蛋白质印迹显示，与转染相同量质粒的亲本细胞相比，外源性DDX3Y蛋白在克隆2中的水平更高，倍数变化约为6.9。为了测试这种效应是否是由克隆2中DDX3X水平降低引起的，我们在亲本U87MG细胞中敲低了DDX3X，也观察到外源性DDX3Y蛋白的显著增加。从同一批细胞中提取的mRNA的RT-qPCR结果表明，表达外源性DDX3Y的细胞所含的DDX3Y mRNA是模拟转染细胞的300倍。因此，总的DDX3Y mRNA基本上代表了外源性转录本。在DDX3X敲低后，未发现DDX3Y mRNA有显著变化，这表明DDX3X在蛋白质水平（如翻译或周转）调控DDX3Y。为了检查DDX3X对DDX3Y周转的潜在影响，我们用翻译阻断剂环己酰亚胺处理细胞，并监测外源性DDX3Y的降解。在亲本U87MG中，DDX3Y蛋白在CHX处理4小时内变得无法检测到。相比之下，在内源性DDX3X减少的克隆2细胞中，DDX3Y蛋白的降解大大减慢。有趣的是，尽管与DDX3Y具有高度序列同源性，但DDX3X要稳定得多，即使在CHX处理12小时后，仍有超过80%的蛋白质保留。这些结果表明，DDX3X促进了U87MG细胞中DDX3Y蛋白的周转。
DDX3X与DDX3Y相互作用，后者包含两个导致其稳定性较低的赖氨酸残基
DDX3X和酵母同源物Ded1p已被证明可以形成寡聚体以协同解旋RNA双链体。基于DDX3X和3Y之间的高度序列同源性，我们假设这两个旁系同源物相互作用。为了验证这一假设，我们在克隆2细胞中共同表达了C末端HA标签的DDX3Y和FLAG标签的DDX3X，并使用与抗HA抗体结合的琼脂糖珠进行免疫共沉淀。结果显示，Flag标签的DDX3X与HA标签的DDX3Y一起被沉淀下来。同样，在亲本U87MG细胞中，内源性DDX3X也与HA标签的DDX3Y共沉淀，进一步证实了DDX3X与DDX3Y的结合。
众所周知，赖氨酸残基的翻译后修饰（如泛素化）会触发蛋白质降解。在DDX3X的32个赖氨酸残基中，有三个与泛素介导的降解有关；然而，这三者都与DDX3Y共享，因此不太可能导致两种蛋白质稳定性之间的差异。为了鉴定导致DDX3Y不稳定的残基，我们利用了DDX3X和3Y之间高度的序列同一性。序列比对显示，DDX3Y上有两个赖氨酸残基，K250和K546，它们在DDX3X的相同位置上被精氨酸残基取代。因此，我们将DDX3Y上的这两个赖氨酸残基分别替换为精氨酸。当用编码每种蛋白质的等量质粒转染U87MG细胞时，K250R和K546R突变体的表达水平都远高于野生型DDX3Y，表明这两个残基都导致了DDX3Y的不稳定。结合这两个突变并没有进一步稳定DDX3Y。此外，用蛋白酶体抑制剂MG132处理可以保护野生型DDX3Y，但不能保护K250,546R突变体。总之，这些结果表明，K250和K546（这是DDX3Y特有的）将该蛋白质靶向蛋白酶体介导的降解途径。
讨论
我们观察到DDX3X抑制DDX3Y水平的两种不同机制。在HCT116细胞中，敲低DDX3X导致内源性DDX3Y mRNA和蛋白水平适度增加，可能是通过增强DDX3Y mRNA稳定性实现的。相反，在U87MG细胞中降低DDX3X不影响DDX3Y转录本水平，但会稳定DDX3Y蛋白。这种差异可能归因于不同细胞类型中DDX3Y mRNA和蛋白质降解机制的效率不同。例如，有研究表明DDX3Y蛋白在HEK293T细胞中非常稳定，这表明这些细胞缺乏有效的DDX3Y蛋白降解机制，必须依赖其他机制（如DDX3Y mRNA周转）来缓冲DDX3X的任何改变，因为维持相对稳定的总DDX3活性至关重要。在U87MG细胞中，DDX3Y的稳定性远低于DDX3X，并且我们能够鉴定出导致DDX3Y稳定性较低的两个赖氨酸残基。由于我们还发现DDX3X和3Y相互作用，我们的数据支持一个模型，即DDX3X结合DDX3Y以促进其降解。DDX3X可能通过招募E3泛素连接酶来做到这一点，但我们未能检测到与野生型蛋白相比，稳定的DDX3Y突变体的泛素化程度降低。或者，DDX3X可能将DDX3Y招募到应激颗粒等细胞器以加速其降解。需要进一步的研究来阐明这些可能性。
DDX3X活性失调与许多疾病有关，其中一些具有性别二态性。例如，DDX3X综合征主要影响女性，而伯基特淋巴瘤则偏向于男性。在DDX3X综合征的小鼠模型中，神经祖细胞中Ddx3x的缺失会导致Ddx3y mRNA增加。根据我们在HCT116细胞中的结果，测试这种增加是否也归因于Ddx3y mRNA稳定性的增强将是有意义的。然而，尚不清楚这种增加如何转化为体内的Ddx3y蛋白水平，并且小鼠和人类的神经发育似乎受DDX3X突变的影响不同。因此，很难预测人类中是否也会发生类似的DDX3Y mRNA代偿性上调，以及如果发生，是否对DDX3X综合征的性别二态性有任何贡献。事实上，最近一项关于男性DDX3X综合征的研究表明缺乏DDX3Y的补偿。在B细胞淋巴瘤发生中，DDX3Y蛋白仅在已建立的雄性淋巴瘤细胞中检测到，而在正常雄性B细胞中检测不到。这种异位DDX3Y表达被认为有助于在伯基特淋巴瘤和其他具有频繁DDX3X突变的男性偏向性癌症中观察到的性别二态性。值得注意的是，这种异位表达可能不是由DDX3Y mRNA的增加或DDX3X对DDX3Y翻译的直接抑制引起的，并且似乎是在DDX3X缺失数周后才变得明显的长期效应，这表明需要额外的改变。与HCT116细胞不同，在亲本U87MG细胞中，无论是否敲低DDX3X，内源性DDX3Y mRNA和蛋白质基本上都无法检测到，在克隆2中也是如此。然而，在DDX3X减少后，观察到仅包含编码序列但不包含5‘或3’非翻译区构建物表达的外源性DDX3Y蛋白立即且显著的上调，这主要是由于DDX3Y蛋白的稳定。因此，在DDX3X功能丧失后，可能需要额外的改变来缓解转录和翻译抑制，内源性DDX3Y蛋白才会变得丰富。
在哺乳动物性染色体进化过程中，大多数基因从Y染色体上丢失，但保留在X染色体上。在仅保留在X和Y染色体上的17个人类基因对中，DDX3X和3Y是独特的，因为它们对剂量异常敏感。此外，在许多男性人类组织中检测不到DDX3Y蛋白，这与该蛋白质具有有害效应（如上述致癌效应）相一致。已进化出一种使人类DDX3Y蛋白水平保持较低的机制，即某些DDX3Y转录本中5‘非翻译区的AUG三联体对翻译的抑制。在我们尝试敲除U87MG细胞中DDX3X的过程中，细胞通过利用一个原本不在阅读框内的AUG来恢复开放阅读框，从而应对CRISPR/Cas9产生的移码突变。然而，该克隆中DDX3X蛋白的表达水平大大降低，这可能是由于现在位于5‘非翻译区的原始AUG对翻译的抑制所致，这模拟了自然界中进化出的对DDX3Y翻译的抑制。抑制DDX3Y水平的另外两种机制是DDX3X对DDX3Y mRNA和蛋白质的去稳定作用，正如我们在此描述的。这两种机制也通过诱导DDX3Y的相反反应来保护细胞免受DDX3X水平失调的影响，以保持总DDX3剂量的稳定。这种保护作用在DDX3X综合征中显然被破坏了，因为DDX3Y无法补偿男性患者中DDX3X蛋白或活性的丧失。相反，肿瘤细胞可能劫持这些机制来异位表达DDX3Y以克服DDX3X的缺失。完全理解这些机制可能会通过靶向DDX3Y表达，为这些疾病带来新的治疗方法。
