《Frontiers in Neuroscience》：The delivery challenge of adeno-associated virus vector-based gene therapies for neurological diseases
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这篇前沿综述聚焦于运用重组腺相关病毒（rAAV）载体治疗中枢神经系统（CNS）疾病时，突破血脑屏障（BBB）这一核心递送难题。文章系统梳理了从物理屏障（如内皮细胞间紧密连接）到生物屏障（如免疫反应）的递送挑战，并重点探讨了通过合理设计、定向进化与计算机辅助（in silico）设计等策略优化病毒衣壳，以提升其穿越血脑屏障的效率和细胞靶向特异性。此外，综述还介绍了“旁观者效应”（cross-correction）等规避递送限制的策略，并展望了相关临床试验的未来方向与挑战。
引言
基因疗法领域有望彻底改变医学现状，为包括中枢神经系统（CNS）疾病在内的多种疾病提供个性化治疗方案。腺相关病毒（AAVs）作为基因疗法的递送载体被广泛研究。然而，将基于重组AAV（rAAV）载体的基因疗法应用于神经系统疾病，面临着诸多挑战，其中最关键的一环便是实现高效、安全的CNS递送。这篇综述旨在介绍并更新该领域的最新进展。
物理屏障
要抵达中枢神经系统的靶细胞，rAAV载体必须克服一系列物理屏障。首先是血脑屏障（BBB），它由毛细血管内皮细胞（BECs）构成，顶端通过紧密连接（TJs）相互连接，严重限制了分子和病毒从血液进入脑实质。此外，基底膜（BM）、细胞外间隙中的间质基质以及包裹神经元胞体和树突的神经元周围网络（PNNs），都构成了递送途中的阻碍。
AAV衣壳由60个病毒衣壳蛋白（VP1， VP2， VP3）原聚体组装成二十面体结构，其与环境（包括靶细胞）的相互作用主要由衣壳表面的突起，特别是超变区（VR）IV和VIII介导。
rAAV载体主要通过受体介导的胞吞转运（RMT）或小窝介导的胞吞转运（CMT）等主动运输方式穿过BECs。此外，在某些情况下，如使用甘露醇、聚焦超声等方法暂时破坏BBB完整性时，也可发生细胞旁路运输。
AAV9及其在脊髓性肌萎缩症（SMA）基因疗法中的应用
在开发用于CNS疾病的基因疗法方面，AAV9血清型因其衣壳在天然AAV中具有相对较高的穿越人类BBB的能力而备受关注。基于此开发的奥那西农原倍阿帕韦（onasemnogene abeparvovec，OA，商品名Zolgensma?）是首个获得FDA批准的用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA）的AAV递送基因疗法。SMA是由运动神经元生存1（SMN1）基因缺失或功能障碍引起的神经肌肉疾病。
OA的成功临床应用带来了宝贵的经验，但也凸显了挑战，包括剂量相关的毒性风险（如肝毒性、背根神经节感觉神经元病变）、疗效的个体差异，以及长期疗效和安全性（如SMN1基因可能被表观遗传沉默或在分裂细胞中被稀释）的不确定性。
提高天然AAVs脑渗透性的方法
目前优化rAAV衣壳的方法主要可分为三类：理性设计、定向进化和计算机辅助设计。
理性设计通常依赖于通过定点诱变对rAAV衣壳进行靶向修饰，例如将表面暴露的酪氨酸或苏氨酸替换为极性较小的苯丙氨酸或缬氨酸。也包括插入或交换已知功能的肽段序列，例如在AAV9中插入含有RGD基序的肽段获得了主要靶向星形胶质细胞的衣壳AAV9P1。化学修饰和计算机模拟对接算法也为理性设计提供了支持。
定向进化通过构建多样化的AAV衣壳变体库，然后通过筛选过程分离和鉴定具有所需特性的衣壳。一些高效的筛选平台包括基于Cre重组的AAV靶向进化（CREATE）、通过细胞类型特异性RNA表达重定向AAV（TRACER）以及利用体内转基因RNA表达的AAV衣壳定向进化（DELIVER）。筛选出的候选衣壳还需进行靶点解析，以明确其转导机制。
计算机辅助设计利用计算方法克服传统理性设计的局限，包括基于系统发育分析的祖先重建（如Anc80L65衣壳）以及利用机器学习（ML）模型基于实验数据设计具有所需特性的多样化rAAV衣壳变体。例如，Fit4Function方法可以同时优化多个理想性状（如高产率和高肝脏靶向性）。混合方法（如先定向进化筛选，再进行理性工程改造）也在应用。
用于CNS应用的有前景的rAAVs
研究已开发出多种具有改进脑靶向性或细胞类型特异性的rAAV衣壳。例如，通过CREATE方法筛选出的AAV-PHP.B及其衍生物在小鼠中显示出强大的脑嗜性，但其效能依赖于小鼠Ly6a蛋白的表达，在灵长类动物中效果不佳。为克服物种差异，研究人员通过多物种筛选策略获得了在旧大陆猴（如食蟹猴）中具有良好CNS嗜性的衣壳AAV.CAP-Mac。
其他有前景的衣壳包括在非人灵长类动物中筛选出的9P801，其肝脏和背根神经节靶向性低，而脑神经元靶向性高；靶向人转铁蛋白受体（TFR1）的BI-hTFR1衣壳；以及Sangamo Therapeutics开发的STAC-BBB衣壳，其在食蟹猴大脑中表现出优异的脑嗜性和显著降低的周围组织靶向性。
对于需要靶向特定细胞类型的疾病，也开发了相应的衣壳。例如，AAV-BR1和其衍生物AAV-BR1N分别靶向脑内皮细胞和神经元；AAV-MG1.1/1.2曾被报道靶向小胶质细胞，但后续研究对其特异性提出了质疑；AAV-X1.1主要靶向脑内皮细胞；而通过多种天然AAV衣壳序列洗牌和定向进化获得的Olig001，则对少突胶质细胞表现出高特异性（>95%），可用于治疗如Canavan病等脱髓鞘疾病。
如果缺乏具有特定细胞类型嗜性的衣壳，仍可通过使用细胞类型特异性启动子或增强子元件来限制有效载荷的表达，从而实现细胞类型特异性。
预测人类BBB渗透性
在将基因疗法静脉注射给人类之前，必须测试其递送载体克服人类BBB的能力。经典的体外分析模型是Transwell系统。更复杂的“芯片器官”3D细胞培养模型能在微流体通道中模拟脑血流的生理剪切应力，更真实地再现BBB微环境。
所有BBB模型系统的核心是在半透膜上生长紧密的内皮细胞（ECs）单层，模拟血管管腔的顶端腔室和模拟脑实质环境的基底外侧腔室。屏障形成的程度可通过跨内皮电阻（TEER）测量来评估，也可通过检测紧密连接蛋白的表达与分布、P-糖蛋白的极性定位以及荧光染料（如荧光素钠、Lucifer Yellow）的旁细胞渗透性来直接评估屏障完整性。
用于构建BBB模型的人内皮细胞来源包括原代或永生化内皮细胞（如hCMEC/D3细胞系），以及由人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化而来的内皮细胞。hiPSC来源的细胞具有更高的膜完整性（TEER值高），但将其分化为真正意义上的内皮细胞仍具挑战。此外，血管化的类脑器官也被越来越多地用于新型rAAV衣壳的鉴定和脑靶向基因疗法的临床前评估。
细胞类型/区域选择性基因疗法与旁观者效应
鉴于即使在非人灵长类动物中，系统性给药的rAAV载体也难以转导大部分脑细胞，需要策略来规避这一限制。
一种策略是聚焦于病因具有强烈区域集中性的神经系统疾病。例如，亨廷顿病（HD）的病理进展受纹状体影响巨大。通过MRI引导的手术将携带治疗性微RNA（如靶向HTT基因的AMT-130）的AAV5载体直接注射到纹状体及其附近的六个深部脑区，已在临床试验中显示出延缓疾病进程的潜力。进一步使用对深部脑结构有选择性嗜性的衣壳（如AAV-DB-3）可能提升疗效。
另一种策略是依赖于旁观者效应（CC）。该概念最初在溶酶体贮积症（LSD）的治疗中获得关注。在CC中，可被现有方法转导的细胞（如肝脏细胞或脑内皮细胞）被改造成“工厂”，分泌疾病校正蛋白，从而影响邻近细胞。例如，通过静脉注射靶向脑内皮细胞的AAV-BR1衣壳递送Npc2基因，可在小鼠模型中广泛恢复Npc2蛋白表达，缓解尼曼-匹克C2型病的症状。
对于阿尔茨海默病（AD），将保护性的APOE-ε2蛋白分泌到细胞外空间也是一种CC策略。临床前研究表明，在AD小鼠模型中表达APOE-ε2可显著减少Aβ斑块密度和神经炎症。Lexeo Therapeutics公司正在开展多项使用AAVrh10载体递送APOE-ε2基因疗法的临床试验。对于非天然分泌的蛋白，可通过蛋白质工程（如添加分泌信号肽和细胞穿膜肽）使其具备分泌和跨细胞能力，从而实现旁观者效应。
值得关注的研究
尽管AAV9载体（如OA）取得了早期成功，但在临床上静脉注射rAAV载体治疗CNS疾病仍面临挑战。目前，尚无临床批准的基因疗法使用经过CNS应用优化的rAAV衣壳。近期一项使用新型衣壳CAP-002的临床试验（SYNRGY研究）中发生了一起儿童死亡事件，这为整个领域敲响了警钟，强调了深入理解载体安全性（包括免疫反应和基因组潜在的细胞毒性）的重要性。
然而，该领域的研究势头依然强劲。例如，Lexeo Therapeutics公司针对APOE-ε4纯合子患者的AAVrh10-APOE-ε2基因疗法临床试验已显示出降低脑脊液tau生物标志物等积极信号。Sangamo Therapeutics公司则利用其高效的STAC-BBB衣壳递送锌指蛋白阻遏物（ZFRs），旨在降低朊病毒蛋白（PrPC）或tau蛋白的表达，在临床前模型中展现了强大的治疗潜力，其针对朊病毒病的首个人体临床试验预计将于2026年启动。
结论
解决基因疗法安全高效递送至CNS的挑战是一项紧迫而未满足的需求。针对rAAV作为首选递送载体的研究正在快速推进。现在人们越来越认识到，即使对rAAV衣壳的微小改变也可能对其嗜性和跨物种效力产生深远影响。同时，在进行临床研究时，必须充分考虑年龄、给药途径和血清阳性状态等多种因素。尽管存在挫折，但这项递送平台技术正日趋成熟。充满希望的衣壳不断涌现，它们能够被纯化到高滴度和高纯度，可靶向已知的细胞摄取受体，具有外周脱靶性低和跨物种效力强等优点。机器学习等工具开始助力多性状衣壳的优化。模块化的任务性质使得协同合作和多个领域的渐进式进步成为可能。近期报道的番鸭AAV分离株AAV.div3A能够逃避哺乳动物免疫系统，这为血清阳性患者或需要重复给药的患者带来了希望。实现rAAV的重复给药将极大地拓宽其治疗窗口。最终，一旦获得满足高标准要求的工具和方法，这些解决方案将有望用于递送有效的基因疗法，治疗多种CNS疾病。
