《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：DPP4 inhibition affects metabolism and inflammation associated pathways in hiPSC-derived steatotic HLCs
编辑推荐：
本研究构建了人诱导多能干细胞（iPSC）来源的脂肪变性肝样细胞（HLC）模型，揭示了代谢功能障碍相关脂肪肝病（MAFLD）中二肽基肽酶4（DPP4）活性升高及其与炎症、代谢通路的关联。通过抑制DPP4活性，部分逆转了脂肪变性表型，为理解MAFLD的肝细胞内在机制及DPP4抑制剂的治疗潜力提供了新见解。
引言
脂肪肝病已成为全球工业化国家日益严重的健康负担。其早期、可逆阶段包括脂肪变性和脂肪性肝炎，可进一步发展为不可逆的纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌。肥胖和2型糖尿病（T2DM）是代谢功能障碍相关脂肪/脂肪变性肝病（MAFLD/MASLD）的直接诊断标准。这是一种复杂的多系统疾病，治疗选择有限，瑞美替罗（resmetirom）是目前唯一获得FDA批准的MASLD治疗药物。二肽基肽酶4（DPP4，又称CD26）是一种丝氨酸蛋白酶，参与炎症、感染、免疫疾病、T2DM、肾脏疾病和癌症等多种病理过程。DPP4被认为是肝脏因子，在代谢性肝病中上调，并是炎症的驱动因子。DPP4抑制剂（如维格列汀VILDA）已用于T2DM治疗。本研究旨在利用iPSC衍生的HLCs模型，阐明DPP4在MAFLD发展中的作用及其与代谢和炎症的关联。
材料与方法
本研究使用了来自四个个体的iPSC系（两个健康对照，两个重度脂肪变性患者），并采用已发表的二维分化方案将其分化为HLCs。通过免疫细胞化学、qRT-PCR、蛋白质印迹和细胞色素P450活性测定对分化阶段进行表征。使用400 μM油酸（OA）处理HLCs 7天以诱导脂肪变性表型，并通过BODIPY和PLIN2染色确认脂滴形成。在OA诱导48小时后，加入30 μM VILDA共同处理5天以抑制DPP4活性。通过基于NGS的全转录组分析、ELISA检测DPP4分泌、DPP4活性测定以及细胞因子阵列分析，研究OA和VILDA处理对基因表达、蛋白分泌和炎症因子谱的影响。使用KEGG和GO通路富集分析对差异表达基因进行功能注释。
结果
1. iPSC衍生的肝样细胞（HLC）分化与表征
成功将来自四个供体的iPSCs分化为HLCs。分化效率高，超过90%的细胞表达DE标志物SOX17和HE标志物HNF4a，至少80%的HLCs表达HNF4a。HLCs显著上调了肝细胞标志物ALB、CYP3A4和CYP2D6的基因表达，并表现出CYP3A4和CYP2D6酶活性，证实了其功能性。
2. 油酸（OA）诱导HLCs脂肪变性表型
OA处理成功在所有细胞系中诱导了PLIN2包被的脂滴形成。转录组分析显示，OA处理后，三个细胞系（Cntrl 1, Cntrl 2, Stea 1）的基因表达聚类主要依据处理方式而非遗传背景。通路分析发现，谷胱甘肽代谢等通路基因显著下调，而PPAR信号通路、AMPK信号通路、脂肪酸代谢、TNF信号通路和NF-κB通路等与脂肪变性和炎症相关的基因显著上调。qRT-PCR验证了PLIN2、FABP1、CPT1A等基因的上调趋势，表明成功诱导了与MAFLD相关的分子表型。
3. OA处理促进DPP4分泌和活性
通过对脂肪变性HLCs分泌组的分析，发现DPP4是潜在的关键介质。ELISA检测证实，OA处理后，HLCs分泌的DPP4显著增加，其中健康对照细胞系的增加幅度（约4-5倍）大于患者来源细胞系（约2倍）。然而，DPP4的基因和蛋白表达水平并未发生显著变化。重要的是，DPP4的酶活性在OA处理后显著升高。
4. 维格列汀（VILDA）抑制DPP4活性并调节基因表达
VILDA处理不影响DPP4的mRNA、蛋白表达或分泌，但能显著降低由OA诱导升高的DPP4酶活性，使其恢复到模拟处理水平。这表明VILDA主要作用于DPP4的活性而非其表达。
对Cntrl 1细胞系的全转录组分析表明，VILDA对基因表达的影响弱于OA。差异表达基因分析发现，在OA基础上加用VILDA后，有29个基因显著上调，31个基因显著下调。通路富集分析显示，VILDA处理下调了与炎症性肠病、哮喘和1型糖尿病（T1DM）相关的通路基因，其中HLA-DQA1和HLA-DMB是这些通路的共有基因。qRT-PCR证实，HLA-DMA、HLA-DMB和HLA-DRB1在OA处理后表达有升高趋势，而在OA+VILDA处理后呈现下调趋势。
另一方面，VILDA处理上调了与嘌呤代谢和脂肪酸生物合成相关的代谢通路基因。例如，参与嘌呤代谢的TKFC和NT5C2在OA处理后下调，而VILDA处理使其表达回升。参与脂肪酸代谢的AGPAT2在OA处理后上调，VILDA处理进一步增强了这种上调。PLIN3基因表达也呈现类似趋势，但其蛋白水平无显著变化。
讨论
本研究建立的iPSC-HLC模型成功再现了MAFLD的关键特征，包括脂质积累和与疾病相关的代谢、炎症通路失调。OA诱导的脂肪变性触发了PPAR、AMPK、TNF和NF-κB等关键通路的改变。
研究发现，脂肪变性HLCs分泌的DPP4活性显著增加，而DPP4的表达水平不变，提示DPP4的调节可能发生在翻译后或分泌水平。使用DPP4抑制剂VILDA可有效降低其酶活性。
转录组学分析表明，VILDA处理部分逆转了OA引起的基因表达变化：它下调了与炎症（特别是HLA II类分子相关）通路相关的基因，同时上调了嘌呤和脂肪酸代谢相关基因。这提示DPP4抑制可能在脂肪变性背景下，通过调节代谢和炎症之间的相互作用产生有益影响。尽管VILDA也可能抑制DPP8/9，但考虑到DPP9在模型中表达水平很低，观察到的效应很可能主要由DPP4抑制介导。
研究局限性包括样本量较小、患者与对照细胞系间的差异有限，以及VILDA的效应相对温和。未来需要更多细胞系、更长时间的处理以及包含多种肝脏细胞类型的复杂模型（如类器官或共培养系统）来进一步阐明DPP4在MAFLD中的精确作用机制。构建人DPP4敲除的HLCs模型将有助于剖析DPP4在肝细胞自主性功能中的作用。
结论与展望
综上所述，本研究利用人iPSC衍生的HLCs模型，聚焦于肝细胞在脂肪变性进展中的特异性贡献。研究发现DPP4活性与脂肪变性表型相关，并且用VILDA抑制DPP4活性，能在全转录组水平上部分缓解脂肪变性表型，影响代谢和炎症相关通路。这些发现为理解DPP4在MAFLD肝细胞内在机制中的作用提供了新见解，并支持进一步探索DPP4抑制剂在该疾病中的治疗潜力。未来，将人DPP4敲除HLCs整合到多细胞肝脏模型中，将有助于更全面地理解DPP4在健康和疾病状态下的作用机制，以及肝脏内不同细胞类型之间的相互作用。
