《Frontiers in Allergy》：Long-term Qipian? administration confers resistance to airway inflammation in OVA-induced asthmatic mice
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本研究揭示了长期口服细菌溶解产物奇片?（Long-term Qipian? administration, LTQA）在小鼠过敏性哮喘模型中的预防性作用及潜在机制。研究证实，为期三个月的LTQA预处理可显著减轻卵清蛋白（OVA）诱导的气道炎症、炎性细胞浸润及黏液高分泌。其作用机制涉及重塑Th1/Th2平衡（降低IL-4、IL-5、IL-13，提升IFN-γ和IL-10）、扩增调节性T细胞（Tregs）和CD103+树突状细胞（DCs）、降低神经激肽（NKA, NKB）水平，并增加肠道中乳杆菌（Lactobacillus）的丰度。这些发现为通过调节免疫反应和肠道菌群（支持肺-肠轴）来管理哮喘提供了新的临床策略思路。
引言：哮喘防治的新思路
哮喘是一种影响全球约1%-9%人口的慢性气道炎症性疾病，其特征是反复发作的咳嗽、呼吸困难、喘息等症状，伴随可逆性气流受限，最终导致气道重塑和狭窄。尽管传统的抗炎疗法（如吸入性糖皮质激素）和新兴的生物制剂已显著改善了哮喘的控制，但发病率仍在快速上升。越来越多的证据表明，旨在改变适应性免疫失衡的免疫调节策略可能是预防哮喘的最佳途径。细菌溶解产物（Bacterial Lysates, BLs）作为一种免疫调节剂，在哮喘治疗中显示出潜力。奇片?（Qipian?）是一种冻干的、分级的碱性提取物，来源于卡他莫拉菌、枯草芽孢杆菌和白色葡萄球菌三种不同的菌属，在中国已有超过30年的临床使用历史，用于治疗慢性支气管炎。既往研究表明，短期奇片?治疗可缓解已建立的哮喘炎症，但其长期给药（LTQA）的预防效果及潜在机制尚不清楚。
材料与方法：严谨的小鼠模型构建与分析
研究使用60只6周龄雌性Balb/c小鼠，将其分为六组。其中两组小鼠每日口服25 mg/kg剂量的奇片?，持续90天。随后，按照既定方案建立OVA诱导的哮喘模型。实验设计时间线详见图1A。模型建立后，收集小鼠的肺组织、血液、支气管肺泡灌洗液和粪便样本进行分析。分析内容包括：嗜酸性粒细胞、免疫球蛋白（Igs）、Th1/Th2细胞因子的定量；通过过碘酸希夫（Periodic acid-Schiff, PAS）染色评估肺黏液；通过流式细胞术表征树突状细胞和调节性T（Treg）细胞群；并通过16S rDNA测序分析肠道菌群。同时，对小鼠的哮喘症状（打喷嚏、抓鼻、喘息）进行同步评分。
结果一：LTQA显著缓解哮喘肺部病理特征与症状
OVA致敏和激发显著诱导了气道炎症，其特征是肺组织中嗜酸性粒细胞浸润和黏液积聚。组织学检查（H&E染色）显示，LTQA能显著减轻这些病理特征，减少炎症细胞浸润，其效果与阳性药物地塞米松（DEX）相当。对BALF的细胞学分析进一步证实，LTQA显著降低了OVA诱导的嗜酸性粒细胞计数的升高（图1F, J）。此外，LTQA还能有效抑制OVA诱导的哮喘行为评分（打喷嚏、抓鼻、喘息）的升高。
结果二：LTQA调节体液免疫应答
在OVA诱导的哮喘模型中，体液免疫应答被显著激活，表现为血清和BALF中总免疫球蛋白E（IgE）、OVA特异性IgE和免疫球蛋白G（IgG）水平显著升高。LTQA预处理显著降低了这些免疫球蛋白的水平，表明其对OVA诱导的体液免疫反应具有抑制作用。与先前关于奇片?短期治疗的研究发现不同，LTQA对血清和BALF中免疫球蛋白A（IgA）的分泌抑制效果最小，甚至在OVA激发后增加了BALF中的IgA水平。这表明LTQA以不同的方式调节全身性和黏膜体液免疫。
结果三：LTQA重塑细胞因子格局，恢复Th1/Th2平衡
CD4+T细胞，特别是Th2细胞，是协调哮喘免疫反应的关键效应细胞。研究检测了BALF中Th1/Th2细胞因子的分泌。结果显示，LTQA有效缓解了OVA诱导的Th2细胞因子，包括白介素-4（IL-4）、IL-5和IL-13的升高。相反，LTQA增加了Th1细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）和调节性细胞因子IL-10的浓度。IL-5在气道炎症中通过调节嗜酸性粒细胞的募集、激活和存活发挥重要作用，LTQA对IL-5的抑制作用与观察到的BALF嗜酸性粒细胞减少一致。此外，已知IL-33/ST2通路驱动2型免疫和过敏性病理，LTQA也降低了IL-33的释放。这些变化共同促进了Th1/Th2免疫平衡的恢复。
结果四：LTQA促进调节性T细胞和CD103+树突状细胞的扩增
调节性T（Treg）细胞（表达CD4、CD25和Foxp3）在哮喘发病机制中至关重要。流式细胞术分析显示，在非哮喘小鼠中，LTQA治疗与Treg细胞比例显著增加相关。相反，OVA激发显著降低了Treg细胞比例。值得注意的是，LTQA给药给哮喘小鼠恢复了这个缺陷，使其Treg水平显著高于PBS处理的OVA模型组。此外，研究还考察了CD103+树突状细胞（DCs），这是一类关键的抗原提呈细胞，已知在小鼠中能启动初始T细胞分化为Tregs。数据显示，与PBS和OVA对照组相比，LTQA治疗显著增加了CD11c+I-A/I-E+CD11b-CD103+DCs的频率。鉴于这个DC亚群已被证明能促进CD4+Foxp3+Treg细胞的生成，研究中观察到的CD103+DCs和Treg细胞的同步扩增可能是相互关联的。
结果五：LTQA抑制神经激肽水平，改善症状
嗜酸性粒细胞会增加哮喘中气道感觉神经（Airway Sensory Nerves, ASNs）的密度。当被免疫细胞的炎症介质激活时，ASNs会释放神经激肽，如P物质（Substance P, SP）、神经激肽A（Neurokinin A, NKA）和神经激肽B（Neurokinin B, NKB）。研究发现，OVA激发显著升高了肺组织中的神经激肽水平，而LTQA和DEX均能减弱这种效应。同时，两种治疗都降低了哮喘症状评分。这些发现表明，LTQA的有益效果与降低的神经激肽信号相关。
结果六：LTQA影响肠道微生物组，支持肺-肠轴
越来越多的证据表明，肠道菌群的稳态和失调与哮喘患者和小鼠的保护及发病机制有关。通过对粪便样本进行16S rDNA测序，研究发现，在属水平上，六组小鼠肠道菌群的α多样性（香农指数和辛普森指数）没有显著差异。然而，基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）和相似性分析（ANOSIM）显示，六组之间的β多样性存在显著差异，正常小鼠组和OVA诱导的哮喘组之间观察到明显的细菌菌群分布区别。在肠道菌群的前30个属中，LTQA增加了乳杆菌（Lactobacillus）和寡养单胞菌（Stenotrophomonas）的丰度，并降低了毛螺乳杆菌（Ligilactobacillus）和脱硫弧菌（Desulfovibrio）的丰度。进一步的分析显示，OVA攻击显著增加了葡萄球菌（Staphylococcus）的相对丰度。LTQA治疗显著调节了OVA扰动的菌群，其特征是乳杆菌（Lactobacillus sp. L-YJ）和链球菌（Streptococcus danieliae）的增加，以及几个与梭菌（Clostridia）相关的分类群的减少。这些分析表明，LTQA治疗与肠道微生物群落的特定变化相关，为其通过肺-肠轴产生的全身性效应提供了相关性支持。
讨论：多机制协同的免疫调节
本研究结果表明，LTQA可能通过抵消OVA诱导的Th2主导的免疫反应来帮助缓解哮喘的发展。这与临床研究显示奇片?可通过调节Th1/Th2平衡治疗儿童哮喘的结果一致。LTQA对Th1/Th2平衡的预防作用可能与其对CD4+CD25+Foxp3+调节性T（Treg）细胞的影响有关，而Treg细胞的增加很可能是通过激活CD103+DCs实现的。这与地塞米松（DEX）的作用机制形成对比，DEX作为标准护理治疗基准用于抑制已建立的炎症，其广泛的免疫抑制作用并未引起Treg/DC的扩增，这凸显了两种干预措施所涉及的根本不同的免疫学途径。此外，LTQA在OVA诱导模型中的作用似乎超越了已确立的Th1/Th2平衡调节和Treg扩增，证据显示其与支气管肺泡灌洗液中神经激肽（SP、NKA和NKB）水平的改变相关。神经激肽的调节是LTQA更广泛治疗谱的一部分。最后，本研究发现LTQA治疗改变了肠道微生物组的组成，特别是LTQA组与OVA诱导的哮喘组相比，乳杆菌（Lactobacillus）的丰度增加。这一转变与肠道-肺轴的概念一致，表明肠道微生物群与肺部健康之间存在双向关系。
结论：指向临床应用的潜力
总之，本研究证明，LTQA有潜力减轻OVA诱导的哮喘表型的发展。LTQA似乎通过将Tregs募集到气道并抑制神经源性炎症来帮助恢复Th1/Th2平衡。值得注意的是，其治疗效果与肠道菌群的重塑相关，包括益生菌比例的增加，支持了肺-肠轴的参与。这些结果为探索LTQA作为临床背景下缓解哮喘的策略潜力提供了有价值的见解。
