《Frontiers in Immunology》：Inhaled bovine lactoferrin modulates the p47phox–MPO–NETosis axis in acute lung injury: implications for bioengineered nanomedicine in respiratory infections
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本文系统揭示了急性肺损伤早期，中性粒细胞通过p47phox-髓过氧化物酶（MPO）-中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成轴驱动组织损伤的新机制。研究通过时序蛋白质组学与体内功能验证，首次发现乳铁蛋白（LTF）作为该轴的关键动态调节枢纽，吸入性牛乳铁蛋白（bLF）能有效抑制p47phox磷酸化及下游NETosis，显著减轻肺部炎症与损伤，为开发靶向先天免疫的乳铁蛋白基纳米药物提供了强有力的理论依据。
1 引言
急性肺损伤及其严重形式急性呼吸窘迫综合征，其根本特征是弥漫性肺泡损伤、血管通透性增加和严重低氧血症。尽管通气策略不断优化，但在缺乏有效靶向药物治疗的情况下，死亡率仍然居高不下。中性粒细胞在急性肺损伤的发病机制中起着核心作用。它们在肺微血管和肺泡腔内积聚，释放活性氧、蛋白酶和中性粒细胞胞外诱捕网。中性粒细胞介导的损伤源于以NADPH氧化酶2为中心的氧化爆发。超氧化物的产生需要膜和细胞质亚基组装成NOX2，这一过程关键依赖于p47phox的磷酸化。髓过氧化物酶大量储存在嗜天青颗粒中，随后将H2O2转化为次氯酸和其他强效氧化剂。这些MPO衍生物诱发广泛的细胞损伤：破坏脂质、蛋白质和DNA，破坏内皮和上皮屏障，并驱动NET形成。此外，持续或过度的NETosis会导致急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征中的微血栓形成、气体交换受损和炎症消退延迟。因此，NOX2-MPO-NETosis轴是急性肺损伤发病机制的基础。乳铁蛋白是一种阳离子铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族。它主要由黏膜上皮细胞合成和分泌，同时也由中性粒细胞的次级颗粒合成和储存。作为黏膜先天免疫的关键成分，它具有广泛的抗菌、抗病毒、抗炎和抗氧化活性。乳铁蛋白主要通过螯合铁和活性氧发挥作用，但越来越多的数据表明，它也能调节上游的氧化还原信号和免疫通路。虽然乳铁蛋白在各种炎症环境中都能抑制NET的释放，但其在急性肺损伤中直接调节NOX2-MPO机制的机制仍不明确。
2 材料与方法
本研究使用脂多糖诱导的C57BL/6N小鼠急性肺损伤时序模型，结合无标记肺部蛋白质组学，来描绘损伤发生和消退过程中的动态分子变化。所有动物实验均获得中国农业大学实验动物伦理委员会的批准。通过微喷雾器给予脂多糖诱导急性肺损伤。在炎症高峰期，通过吸入方式给予气溶胶化牛乳铁蛋白进行体内干预。通过组织学、肺损伤评分、肺内炎性细胞因子水平、中性粒细胞浸润评估以及流式细胞术等手段评估损伤和炎症程度。使用液相悬浮芯片技术检测肺部匀浆中多种细胞因子和趋化因子的水平。通过数据非依赖性采集质谱技术进行无标记蛋白质组学分析，并结合主成分分析、差异蛋白筛选、短时序表达挖掘分析、基因集富集分析以及京都基因与基因组百科全书和基因本体论功能富集分析等方法，解析动态分子变化。通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，并使用Cytoscape软件进行深入分析，特别是围绕乳铁蛋白的互作网络。通过Western Blot和实时定量PCR技术检测乳铁蛋白、髓过氧化物酶、p47phox及其磷酸化水平等相关蛋白和基因的表达。通过酶联免疫吸附试验检测肺组织匀浆中白细胞介素-1β、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的水平。
3 结果
3.1 急性肺损伤过程中乳铁蛋白表达动态与中性粒细胞浸润同步
研究利用肺部给予脂多糖建立了急性肺损伤小鼠模型。组织病理学评估证实了损伤的时序性进展，损伤在第一天达到高峰，表现为显著的中性粒细胞浸润、透明膜形成和肺泡内蛋白性碎屑。体重变化和促炎细胞因子谱与这一进展过程一致。内源性乳铁蛋白的表达动态也在脂多糖攻击后被表征。Western Blot和实时定量PCR分析表明，乳铁蛋白的蛋白和mRNA水平在第一天急剧达到峰值，并持续高表达至第三天，在第七天恢复正常。流式细胞术分析显示，肺组织和外周血细胞中的中性粒细胞比例均在第一天达到峰值。这些数据共同表明，中性粒细胞向肺组织的趋化和活化是脂多糖诱导急性肺损伤的核心病理过程，且内源性乳铁蛋白的表达与之紧密同步。
3.2 整合蛋白质组学分析揭示中性粒细胞介导免疫的核心模块在损伤进展中被动态调控
对小鼠肺组织进行数据非依赖性采集质谱分析，获得了高分辨率的蛋白质组图谱。主成分分析显示，脂多糖组的炎症反应在第一天与对照组分离最明显，随后随时间推移逐渐消退，向稳态恢复。对差异表达蛋白进行九象限分析和短时序表达挖掘分析，均鉴定出一个在损伤早期上调的蛋白集合。京都基因与基因组百科全书和基因本体论富集分析一致地显示，该蛋白集合显著富集于“NET形成”、“吞噬体”以及“免疫反应”、“先天免疫反应”等通路和生物学过程。其中，短时序表达挖掘分析中的Profile 7簇包含965个蛋白，其表达模式在第一天和第三天上调，随后在第七天和第十四天下调，这与观察到的病理特征高度一致。对该簇的富集分析再次强调了“NET形成”等中性粒细胞相关通路。
3.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络分析揭示乳铁蛋白是急性肺损伤中中性粒细胞氧化爆发的关键调节因子
基于蛋白质组学特征，研究针对第一天和第三天时间点进行了深入的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析。分别构建了两个以乳铁蛋白为中心的互作网络，在这两个网络中均轻松识别出髓过氧化物酶以及NADPH氧化酶复合物的多个关键亚基，包括编码p47phox的Ncf1、Ncf2和Ncf4。对这些网络内蛋白集合进行京都基因与基因组百科全书富集分析，并通过维恩图与前期筛选的蛋白集合结果进行比较，发现仅有三个通路共享：“NET形成”、“吞噬体”和“利什曼病”。“NET形成”通路图中，髓过氧化物酶、弹性蛋白酶以及p47phox等关键组分均呈现上调状态。通过cytoHubba插件对网络进行评分和聚类，确定了五个核心蛋白，它们在所有算法中均排名靠前，包括基质金属蛋白酶9、白蛋白、乳铁蛋白、结合珠蛋白和髓过氧化物酶。分析证实了乳铁蛋白与髓过氧化物酶之间存在主要相互作用。这些结果促使我们提出假说：在脂多糖诱导的肺损伤发病过程中，乳铁蛋白直接与髓过氧化物酶相互作用，并可能间接调节NADPH氧化酶系统的下游氧化级联反应，从而影响NETosis。
3.4 基因集富集分析验证NET形成是早期急性肺损伤的核心通路
为验证蛋白质表达和功能富集，研究对所有检测到的蛋白进行了基因集富集分析。分析发现，有六个通路在第一天和第三天被特异性富集，而在其他时间点未被富集，其中包括“NET形成”。维恩图分析表明，“NET形成”是唯一与之前机制分析重叠的通路。显示该通路富集蛋白及乳铁蛋白的热图显示，髓过氧化物酶、弹性蛋白酶、肽基精氨酸脱亚胺酶4、Ncf1、Ncf2和Ncf4等蛋白在第一天表达上调，并在第三天持续升高。富集分数图进一步证实，脂多糖在第一天和第三天都强烈激活了“NET形成”通路。这些结果进一步支持了我们的假说，即中性粒细胞在脂多糖攻击后的第一天和第三天的病理进展中起着至关重要的作用，而乳铁蛋白可能成为这一过程中的关键调节因子。
3.5 在炎症高峰期对LTF-p47phox-MPO轴进行功能验证
由于前期结果一致表明第一天是脂多糖诱导肺损伤的炎症高峰点，因此选择该时间点对LTF-p47phox-MPO轴进行功能验证。实验设置了三个组：对照组、脂多糖组和牛乳铁蛋白干预组。酶联免疫吸附试验显示，脂多糖刺激后肺匀浆中白细胞介素-1β、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α水平升高，而牛乳铁蛋白处理减轻了这种升高。组织病理学分析显示，脂多糖组观察到的肺泡出血、中性粒细胞浸润和间质增厚在牛乳铁蛋白干预组得到改善。免疫荧光染色进一步表明，代表中性粒细胞的Ly6G和MPO荧光强度在脂多糖处理后显著增加，而牛乳铁蛋白处理使其降低。实时定量PCR结果显示，肺组织中Ltf、Mpo、Ncf1的mRNA在脂多糖刺激后的第一天上调，而外源性牛乳铁蛋白补充减轻了这些变化。Western Blot结果同样表明，髓过氧化物酶、p47phox和磷酸化p47phox蛋白水平在脂多糖诱导的肺损伤中增加，而牛乳铁蛋白显著下调了它们的表达。
4 讨论
本研究结合动态蛋白质组学和体内功能干预，剖析了乳铁蛋白在急性肺损伤早期由中性粒细胞介导的氧化应激和NETosis所定义的致病轴中的作用。主要发现表明，脂多糖引发早期炎症激增，其特征是显著的中性粒细胞募集以及内源性乳铁蛋白表达在第一天和第三天的短暂上调。多层生物信息学分析一致地将乳铁蛋白确定为中性粒细胞活化和NET形成通路的核心枢纽蛋白，其网络连接性指向p47phox和髓过氧化物酶。值得注意的是，“NET形成”作为一个京都基因与基因组百科全书通路，反复出现在我们蛋白质组学分析的交集中，并在第一天和第三天显示出强烈的特异性富集。在第一天急性肺损伤小鼠模型中的功能验证表明，气溶胶化牛乳铁蛋白显著减轻了肺损伤，抑制了肺部炎症，减少了中性粒细胞浸润，下调了内源性Ltf表达，抑制了Ncf1和Mpo转录水平，并降低了p47phox和髓过氧化物酶蛋白水平。这些数据共同证实了乳铁蛋白作为急性肺损伤期间p47phox-MPO-NETosis轴的动态调节因子的作用。
研究采用了时序模型，揭示了损伤和炎症在第一天至第三天达到高峰，并在第七天至第十四天消退的过程。蛋白质组学分析轨迹与此吻合，且“NET形成”通路在早期差异表达蛋白中高度富集，表明其与损伤急性期紧密耦合。中性粒细胞募集与内源性乳铁蛋白诱导在时间上紧密对应，提示乳铁蛋白是肺部对严重中性粒细胞炎症和氧化应激的早期反应组分。乳铁蛋白与中性粒细胞之间的关系复杂且相互影响，涉及不仅仅是抗氧化保护的机制。在此背景下，髓过氧化物酶作为中性粒细胞活化、氧化应激和NETosis交汇点的关键效应物出现。我们的蛋白质组学和网络分析将乳铁蛋白确定为连接中性粒细胞活化和氧化损伤的关键组分。气溶胶吸入途径具有机制相关性，可实现局部高浓度给药，使牛乳铁蛋白能够直接与肺微环境中的中性粒细胞相互作用。
一个值得进一步讨论的重要问题是，牛乳铁蛋白通过何种主要机制发挥其对p47phox磷酸化和髓过氧化物酶活性的抑制作用。先前研究表明，乳铁蛋白可以抑制TLR-NF-κB/MAPK炎症轴并激活Keap1-Nrf2抗氧化轴。同时，NF-κB和p38/JNK信号通路本身被认为是NADPH氧化酶复合物的重要上游调节因子，而Nrf2的激活被认为可以负向调节NOX2相关蛋白的表达。在本研究中，我们观察到气溶胶化牛乳铁蛋白显著降低了Ncf1 mRNA水平、总p47phox蛋白及其磷酸化水平，同时伴随Mpo转录本和髓过氧化物酶蛋白表达的下降。综合来看，这种变化模式更符合牛乳铁蛋白主要通过调节控制NOX2复合体组装和活化的上游信号事件来发挥作用的观点。
除了其直接的免疫调节作用外，乳铁蛋白作为生物工程纳米药物的平台也具有广阔前景。其特异性结合细胞表面受体的能力使其不仅可以作为治疗剂，还可以作为多功能、低免疫原性的靶向配体或可生物降解的纳米载体。乳铁蛋白可以整合到各种纳米结构中，以创建结合主动靶向和协同药理学的平台。
本研究也存在一些局限性。所有实验均在单一的脂多糖诱导急性肺损伤模型中进行，该模型虽然以中性粒细胞为主导，但并不能完全反映人类急性呼吸窘迫综合征的病因和病理生理异质性。此外，我们关于NETosis的结论基于通路富集以及髓过氧化物酶/Ly6G和NOX2相关分子的变化，而未直接测量其他NET特异性标志物，因此研究结果应被视为NETosis减弱的间接通路水平证据。
5 结论
使用时序性脂多糖诱导急性肺损伤模型，本研究表明中性粒细胞募集、NOX2依赖性氧化应激和NET形成主导了肺损伤的早期阶段，从而建立了乳铁蛋白调节的致病微环境。气溶胶化牛乳铁蛋白显著减轻了肺损伤和肺部炎症，减少了中性粒细胞浸润，下调了内源性Ltf、Ncf1和Mpo转录本，同时伴随p47phox磷酸化降低和髓过氧化物酶蛋白水平下降。这些发现支持了一个模型，即乳铁蛋白作为p47phox-MPO-NETosis轴及相关炎症信号的动态上游调节因子发挥作用，从而限制急性肺损伤中中性粒细胞驱动的氧化应激损伤。此外，作为一种天然存在的、纳米尺寸的、安全性良好的且可实现肺部给药的糖蛋白，牛乳铁蛋白成为一个有机制支持的候选分子，值得进一步转化评估，包括探索其作为靶向调节呼吸系统炎症和感染性疾病先天免疫的可纳米工程化支架。
