Ectoine通过调控p53/p21和p16信号通路减轻H2O2诱导的人角质形成细胞和内皮细胞衰老

《Frontiers in Aging》：Ectoine attenuates H2O2-Induced cellular senescence in human keratinocytes and endothelial cells by modulating the p53/p21 and p16 pathways

本综述通过体外实验评估了渗透压补偿性溶质Ectoine对H2O2诱导的人永生化角质形成细胞（HaCaT）和内皮细胞（EA.hy926）氧化应激衰老的抑制作用及其皮肤安全性。研究表明，Ectoine能通过下调p53/p21和p16信号通路、降低活性氧（ROS）水平、减少细胞凋亡并维持核纤层蛋白B1（Lamin B1）表达，有效减轻细胞衰老表型。这为Ectoine在抗细胞衰老（特别是皮肤衰老）领域的研究和应用提供了实验依据。

　　

背景

随着人们年龄增长，对皮肤状态的关注与日俱增，皮肤皱纹是典型的与衰老相关的现象。皮肤衰老过程可分为内源性衰老和外源性衰老。细胞衰老是衰老的关键驱动因素，可由多种应激源触发，包括活性氧（ROS）和环境因素。多项研究已在动物和体外模型中进行了与皮肤衰竭相关的衰老生物标志物及相关机制通路的研究。暴露于UVB光的皮肤相关细胞（例如角质形成细胞）会表现出DNA损伤、细胞周期停滞，并表达衰老生物标志物，如衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性增加；TP53、CDKN1A和CDKN2A激活；以及Lamin B1表达下调。p16的表达在紫外线照射后以及响应H₂O₂诱导的氧化应激时会迅速上调。据报道，几种天然植物提取物，如根皮素、没食子酸和非索非那定，对人皮肤角质形成细胞中的β-半乳糖苷酶活性、ROS水平以及p53和p16表达具有抑制作用，从而延缓衰老。

Ectoine是一种相容性溶质，首次于1985年在嗜盐光合紫色细菌中发现并结构表征。其保护大分子的机制基于“优先水合”效应，通过在蛋白质周围形成水壳（Ectoine-水复合物）来保护细胞膜免受干燥诱导的反应和随后的炎症反应。此外，细胞膜水合作用的增加改善了脂质层的流动性和功能性，Ectoine还能促进水分子簇的形成。因此，优先排斥模型将Ectoine的稳定作用归因于周围水结构的改变，这不仅能维持细胞内外的渗透压，还能增加含水量。Ectoine不仅能维持细胞内外的渗透压，增强对极端条件的抵抗力并减少经皮水分流失，还能通过在恶劣环境条件下保护整个细胞和生物大分子而具有细胞稳定作用。它还能保护细胞免受氧化损伤，并具有良好的应激保护、功能维持和抗炎特性。最近的研究报道，Ectoine可作为护肤品（如美白、保湿、抗衰老和紫外线防护产品）的添加剂。因此，Ectoine在生物医学开发等领域具有非常好的应用潜力。

HaCaT细胞是源自人皮肤角质形成细胞自发转化的永生化细胞系，其生理特性与皮肤角质形成细胞非常相似，长期以来在皮肤研究领域被视为可靠且稳定的细胞系。EA.hy926内皮细胞作为人脐静脉内皮细胞的融合细胞系，更接近HUVECs且易于体外培养。因此，这些细胞近年来被研究人员广泛采用。

材料与方法

本研究中使用的Ectoine购自Damas-beta。HaCaT细胞购自上海富恒生物技术有限公司。EA.hy926细胞由中药和藏药抗肿瘤课题组友情提供。

细胞以2×10⁵个细胞/毫升的密度接种在适当的培养板中。当细胞汇合度达到约60%时，根据实验设计进行分组和处理。所有细胞均在37°C、5% CO₂的培养箱中培养。

通过CCK-8测定评估细胞毒性。用Ectoine或H₂O₂处理后，向每孔加入10微升CCK-8溶液并孵育0.5小时。使用酶标仪在450纳米处测量吸光度。

使用EdU细胞增殖试剂盒根据制造商说明评估细胞增殖。简言之，细胞经处理后，与EdU溶液孵育2小时，固定并用Apollo染料染色。细胞核用Hoechst 33342复染。使用荧光显微镜获取图像，并使用ImageJ软件将EdU阳性细胞数与总细胞数的比值计算为增殖率。

使用SA-β-gal染色试剂盒根据制造商方案检测细胞衰老。处理后，细胞在室温下用固定液固定15分钟，并与染色液在37°C、无CO₂的条件下孵育过夜。衰老细胞通过在光学显微镜下呈现蓝色染色来识别。

使用DCFH-DA荧光探针测量细胞内ROS水平。处理后，细胞与10微摩尔/升DCFH-DA在37°C孵育20分钟，然后用PBS洗涤，随后立即使用荧光显微镜测量荧光强度。使用ImageJ软件进行定量分析。

使用TRIzol试剂提取总RNA，并使用PrimeScript RT试剂盒合成cDNA。使用SYBR Green Premix在实时PCR系统上进行定量PCR。基因表达水平以内参β-肌动蛋白（β-actin）标准化，并使用2^(-ΔΔCt)方法计算。

使用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，并使用BCA测定法测定蛋白质浓度。蛋白质通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭后，膜在4°C下与抗p53、p21、p16和β-actin的一抗孵育过夜，随后与HRP偶联的二抗孵育。使用ECL底物显影蛋白条带，并使用ImageJ软件进行定量。

在盖玻片上生长的细胞用4%多聚甲醛固定，用0.1% Triton X-100透化，并用5% BSA封闭。样品在4°C下与抗Lamin B1的一抗孵育过夜，随后与荧光二抗孵育。细胞核用DAPI复染，并使用荧光显微镜捕获图像。

使用膜联蛋白V-FITC/PI凋亡检测试剂盒根据制造商说明检测细胞凋亡。处理后，收集细胞，重悬于结合缓冲液中，并与膜联蛋白V-FITC和PI在室温避光条件下染色15分钟。在1小时内通过流式细胞术分析凋亡率。

数据以三个独立生物学重复的平均值±标准差表示。使用Shapiro-Wilk检验评估数据分布的正态性。组间差异通过单因素方差分析，然后进行Tukey事后检验进行多重比较。P值小于0.05被认为具有统计学意义。所有统计分析均使用SPSS 22.0进行。图表使用GraphPad Prism 9生成。

结果

1. 1.
   细胞毒性和形态评估
   为评估Ectoine的生物安全性，通过CCK-8测定检测了其处理24小时后对HaCaT角质形成细胞和EA.hy926内皮细胞的潜在细胞毒性。结果显示，与对照处理相比，浓度范围在0.25至2微摩尔/升的Ectoine处理并未显著降低任一细胞类型的细胞活力，表明在该剂量范围内Ectoine无细胞毒性。形态学观察进一步证实了这些发现，与对照细胞相比，Ectoine处理的细胞保持了正常的细胞结构，没有观察到异常。值得注意的是，在显微镜评估下，Ectoine处理组的细胞密度有所增加，这表明其可能具有促增殖效应，值得通过EdU测定进一步研究。
2. 2.
   H₂O₂诱导的衰老模型的建立
   为了建立氧化应激诱导的衰老模型，HaCaT和EA.hy926细胞暴露于浓度梯度为100-400微摩尔/升的H₂O₂中处理1或2小时。该处理诱导了两种细胞系可辨别的形态学改变，例如细胞数量减少。H₂O₂处理以浓度依赖性方式抑制了两种细胞系的活力。基于对应于约70%-80%细胞活力的常规衰老标准，选择200微摩尔/升H₂O₂处理1小时和100微摩尔/升H₂O₂处理2小时的条件分别诱导HaCaT和EA.hy926细胞的衰老，这些条件用于所有后续实验。
3. 3.
   Ectoine促进增殖并降低衰老相关β-半乳糖苷酶活性
   为了确定Ectoine是否能减轻H₂O₂诱导的增殖停滞，我们进行了EdU掺入实验。细胞在预定的最佳衰老诱导条件下，在H₂O₂暴露前用Ectoine预处理24小时。定量分析表明，Ectoine预处理显著抵消了氧化应激的抗增殖作用。与H₂O₂处理组相比，0.5和1微摩尔/升Ectoine显著增加了HaCaT和EA.hy926细胞中EdU阳性细胞的百分比，表明其有效恢复了增殖能力。这种剂量依赖性的DNA合成增加突出了Ectoine在氧化应激下促进细胞复制的作用。

与衰老表型一致，与对照处理相比，H₂O₂刺激显著增加了SA-β-gal阳性HaCaT和EA.hy926细胞的比例。值得注意的是，用0.5和1微摩尔/升Ectoine预处理显著减弱了这种H₂O₂诱导的SA-β-gal活性增加，证明了其改善应激诱导的过早衰老的强大能力。

1. 4.
   Ectoine降低细胞内ROS水平并维持Lamin B1表达
   我们通过测量H₂O₂诱导氧化损伤后的细胞内ROS水平，研究了Ectoine的抗氧化潜力。H₂O₂暴露在两种细胞类型中都诱导了显著的ROS积累。然而，用0.5微摩尔/升Ectoine预处理显著减弱了这种氧化爆发，将ROS水平降低到与对照组相当的水平。这些结果表明，Ectoine有效清除了角质形成细胞和内皮细胞中的氧化应激。

鉴于核膜完整性的丧失是衰老的一个标志，我们通过免疫荧光评估了Lamin B1的表达。与对照处理相比，H₂O₂处理显著降低了Lamin B1与DAPI的荧光强度比值，表明核膜完整性被破坏。Ectoine预处理显著恢复了Lamin B1的表达，表明它在维持核结构和减轻DNA损伤反应激活方面发挥作用。

1. 5.
   衰老相关基因表达的qRT-PCR分析
   qRT-PCR分析显示，H₂O₂诱导的氧化应激显著上调了两种细胞系中关键衰老相关基因TP53、CDKN1A和CDKN2A的mRNA表达。Ectoine预处理有效抑制了这种H₂O₂触发的上调。具体而言，0.5微摩尔/升Ectoine最有效地下调了HaCaT细胞中的mRNA表达，而在EA.hy926细胞中，0.5-1微摩尔/升Ectoine最有效地抑制了mRNA表达，表明其在氧化应激下有效抑制了核心衰老通路。

鉴于ROS驱动的细胞外基质（ECM）降解是细胞衰老的一个关键特征，我们检测了Ectoine对基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的影响。H₂O₂暴露显著上调了两种细胞类型中MMP9的mRNA表达以及EA.hy926细胞中MMP2的表达。相反，在EA.hy926细胞中，0.5微摩尔/升Ectoine显著抑制了MMP2和MMP9的表达，这表明存在细胞类型特异性的ECM降解调控。

1. 6.
   Ectoine下调衰老相关蛋白表达并抑制细胞凋亡
   蛋白质印迹分析证实了Ectoine在蛋白质水平上的调节作用。虽然H₂O₂处理倾向于增加p16、p21和p53蛋白的表达，但Ectoine预处理显著逆转了这种增加。在两种细胞系中，0.5微摩尔/升Ectoine最有效地抑制了蛋白表达，表明Ectoine在氧化应激条件下有效抑制了衰老相关蛋白的表达。

使用膜联蛋白V-FITC/PI染色的流式细胞术分析表明，H₂O₂显著增加了HaCaT和EA.hy926细胞的凋亡。Ectoine预处理以浓度依赖性的方式显著减弱了H₂O₂诱导的细胞凋亡，证实了其对抗氧化应激诱导的细胞死亡的保护作用。

讨论

在本研究中，我们证明了H₂O₂处理成功诱导了HaCaT角质形成细胞和EA.hy926内皮细胞的细胞衰老，表现为SA-β-gal活性增加、细胞内ROS水平升高、衰老相关标志物表达上调以及Lamin B1表达减少。用Ectoine预处理，特别是在0.50微摩尔/升浓度下，以浓度依赖性的方式显著减轻了这些衰老相关的改变。

细胞衰老可由氧化应激触发，例如暴露于H₂O₂，导致不可逆的细胞周期停滞和特征性表型变化。在本氧化应激诱导的细胞衰老模型中，SA-β-gal活性的增加和衰老标志物的上调证实了细胞衰老的成功建立。Ectoine预处理显著降低了SA-β-gal阳性率，并抑制了p53、p21、p16和MMPs的表达，同时维持了Lamin B1的水平。这些结果表明，Ectoine有效抵消了H₂O₂诱导的皮肤相关细胞的过早衰老。

过量的ROS是衰老的关键驱动因素。研究表明，芒果苷等天然化合物可以通过调节ROS和MMP水平，延缓H₂O₂诱导的皮肤相关细胞的衰老。在我们的模型中，Ectoine预处理显著降低了细胞内ROS水平，并减少了两种细胞类型的凋亡。值得注意的是，虽然凋亡和衰老代表了不同的细胞结局，但Ectoine对H₂O₂诱导的细胞凋亡的抑制可能有助于细胞在氧化应激条件下的整体存活。在HaCaT细胞中观察到的更明显的抗凋亡效应表明细胞类型对Ectoine治疗的反应存在特异性。

p53/p21和p16通路是细胞衰老的核心调节因子。TP53被DNA损伤激活，主要通过其下游靶点CDKN1A诱导细胞周期停滞，而CDKN2A则有助于维持持续的增殖停滞。我们的数据显示，Ectoine下调了H₂O₂处理细胞中p53、p21和p16的mRNA和蛋白表达。基于现有证据，我们提出了两种非排他性的机制可能性：Ectoine可能通过其抗氧化特性在上游发挥作用，减少初始的氧化DNA损伤；或者在下游，在损伤发生后抑制衰老信号通路。观察到的ROS水平降低支持了潜在的上游效应，而对p53/p21和p16表达的调节与下游效应一致。我们认为我们的发现代表了“机制关联”而非直接的机制证明。未来的工作必须结合siRNA和γH2AX/53BP1灶点分析，以辨别Ectoine的保护作用是通过ROS介导的DNA损伤预防发生在上游，还是通过对p53/p16通路的调节发生在下游。

值得注意的是，Ectoine在各种生理模型中，包括肠道炎症模型，已显示出显著的屏障保护和抗炎作用。其潜在机制——例如抑制经典促炎信号通路的激活以及降低关键促炎介质的水平——与皮肤光老化和氧化应激触发的细胞内信号级联反应密切相关。本研究的结果证实，Ectoine有效减轻了H₂O₂诱导的皮肤相关细胞衰老，这种益处可能根植于其对核心炎症和应激通路的广泛调节能力。因此，在肠道模型中观察到的屏障修复和抗炎特性为Ectoine在皮肤相关细胞抗衰老策略中的应用提供了强有力的理论支持和新的研究思路，特别是针对炎症性衰老和皮肤屏障功能受损的策略。虽然我们的研究通过MMP2/9分析为Ectoine对关键衰老标志物的影响提供了证据，但未来的研究应包括MMP活性的蛋白质水平验证和更广泛的衰老相关分泌表型分析，以全面表征衰老相关分泌表型。Ectoine在HaCaT和EA.hy926细胞之间的细胞类型特异性功效差异可能归因于应激反应机制或通路激活的差异，值得进一步研究。此外，氧化应激与其他细胞死亡机制之间的关系也值得关注。最近的研究使用包括细胞模型和体内系统在内的多级实验验证方法，证明了铁死亡在衰老和损伤模型中的作用，这为理解Ectoine的潜在保护机制提供了更广泛的背景。

Ectoine以其稳定生物大分子和在极端条件下保护细胞的能力而闻名。尽管我们的研究侧重于衰老相关基因的表达，但其潜在机制可能涉及“优先水合”，以及与ERK1/2、JNK和P38 MAPK等信号通路的相互作用，值得进一步研究。鉴于其抗炎和膜稳定特性，Ectoine的效用可能扩展到神经保护领域，特别是在阿尔茨海默病中，该疾病涉及氧化应激、蛋白质错误折叠和炎症。未来的工作应采用先进的模型，例如Aβ处理的神经元培养物或转基因阿尔茨海默病模型，以验证其在神经系统中的功效。总之，Ectoine有效抵消了H₂O₂诱导的皮肤相关细胞衰老，支持了其在抗衰老护肤方面的潜力。此外，其多效性机制，包括生物大分子稳定、抗聚集和通路调节，表明其在解决神经衰老及相关疾病方面具有广阔的转化价值，值得开展跨学科研究。