《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Dual-antigen recognition iPSC-derived CAR-T cells for B-cell malignancies: establishment of a COVID-19 vaccine synergy strategy
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本综述聚焦于提升CAR-T细胞疗法在治疗复发/难治性B细胞恶性肿瘤中的持久性与疗效。文章创新性地结合诱导多能干细胞（iPSC）重编程技术，生成了一种可同时靶向肿瘤抗原（CD19）和新冠病毒刺突蛋白的双特异性“功能年轻化”T细胞。该策略旨在利用全球广泛接种的SARS-CoV-2 mRNA疫苗，通过T细胞受体（TCR）再刺激，选择性扩增并维持这些CAR-T细胞的体内活力和肿瘤杀伤功能，为解决CAR-T细胞体内持久性不足与功能耗竭问题提供了新的协同增效思路。
引言
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已显著改善了复发/难治性B细胞恶性肿瘤患者的缓解率与生存期。然而，CAR-T细胞在体内的持久性不足及其功能耗竭，仍是限制其疗效的主要障碍。近年来，“疫苗协同”策略作为一种应对这些限制的新思路被提出，其核心是通过疫苗接种提供的抗原再刺激，来增强CAR-T细胞在体内的扩增、持久性和功能。其中，全球广泛、周期性接种的SARS-CoV-2 mRNA疫苗，因其极高的可及性与安全性，成为一个极具吸引力的T细胞受体（TCR）刺激来源。研究表明，疫苗接种后健康个体外周血中会出现刺突蛋白特异性的CD8+T细胞增多，这表明抗原特异性TCR的接合能够诱导相应细胞毒性T淋巴细胞（CTL）群体的扩增，这提示TCR刺激可能支持CAR-T细胞在体内的增殖与持久性。
我们团队此前的研究表明，利用诱导多能干细胞（iPSC）技术，可以将抗原特异性CTL重编程为功能上恢复年轻状态的T细胞（年轻化CTL；rejTs）。与原始CTL相比，这些rejTs表现出更低的T细胞耗竭，并获得了更年轻的记忆样表型，从而具有长期的体内持久性。在此基础上，我们进一步将CD19-CAR导入源自EBV（Epstein-Barr病毒）潜伏膜蛋白（LMP）-2特异性T细胞的iPSC中，生成了能够通过天然TCR和CAR靶向双抗原的CAR年轻化CTL（CARrejTs）。这些CARrejTs不仅表达CD19-CAR，还保留LMP2特异性TCR，使其能够在暴露于EBV或相应疫苗时发生增殖和记忆分化，从而具备持续有效的抗肿瘤活性潜力。
基于此，我们提出一个创新假设：将疫苗协同策略与保留靶向SARS-CoV-2刺突蛋白的天然TCR特异性的CARrejTs相结合，可通过TCR的再刺激来增强它们在体内的持久性和增殖能力。因此，本研究旨在将CD19-CAR导入源自SARS-CoV-2刺突蛋白特异性CTL的iPSC中，生成可同时靶向CD19和新冠病毒刺突蛋白的双抗原识别CARrejTs（1919-CARrejTs），并评估其细胞毒性、肿瘤抑制的持久性以及由TCR和CAR刺激诱导的增殖能力。
材料与方法
本研究遵循《赫尔辛基宣言》，并获得了顺天堂大学医学院伦理委员会的批准。样本来自携带HLA-A02:01或HLA-A24:02的成年健康志愿者，他们按标准方案接种了BNT162b2 SARS-CoV-2 mRNA疫苗。研究中使用了NALM-6（急性淋巴细胞白血病）、Raji（伯基特淋巴瘤）等多种细胞系作为靶细胞。
通过基因工程构建了包含CD8信号肽、抗CD19单链抗体（scFv）、CD8α茎、4-1BB共刺激域和CD3ζ结构域的慢病毒CD19-CAR载体，并与荧光报告基因mCherry相连。从健康供者外周血单核细胞（PBMC）中，通过与其相对应SARS-CoV-2刺突蛋白肽段（S269或S448）脉冲的自体树突状细胞（DC）共培养，体外扩增并单细胞克隆出SARS-CoV-2特异性CTL。将一个识别HLA-A*02:01限制性S269表位的CTL克隆（COVID19-CTL）重编程为iPSC（COVID19-iPSCs），随后用CD19-CAR慢病毒载体转导这些iPSC，获得CD19-CAR+iPSC（CD19CAR-COVID19-iPSCs）。最后，通过特定的分化方案，将这两种iPSC分别分化为1919-CARrejTs和仅保留TCR特异性的COVID19-rejTs。
研究采用了标准6小时51Cr释放实验评估细胞毒性，通过连续再攻击实验模型评估长期肿瘤抑制能力，并利用基于CFSE（羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯）稀释的增殖分析，比较TCR依赖与CAR依赖的刺激对细胞增殖的影响。通过流式细胞术检测细胞表型、抗原特异性、耗竭标志物（如LAG-3, TIM-3, PD-1, TIGIT）及效应分子（颗粒酶B、穿孔素）的表达。
结果
1. 疫苗接种可在健康供者体内诱导刺突蛋白特异性CD8+T细胞
流式细胞术分析显示，接种SARS-CoV-2 mRNA疫苗后，携带HLA-A02:01或HLA-A24:02的健康供者外周血中，刺突蛋白特异性CD8+T细胞频率显著增加。通过体外用相应刺突蛋白肽段脉冲的自体DC刺激PBMC，可以成功扩增出抗原特异性CTL，并经单细胞克隆获得高纯度克隆。51Cr释放实验证实，这些CTL能特异性裂解HLA匹配、肽段负载的淋巴母细胞样细胞系（LCL），而对HLA不匹配的LCL则无杀伤作用，证明了其细胞毒性的HLA限制性和抗原特异性。
2. iPSC衍生的SARS-CoV-2刺突蛋白特异性CTL保留抗原特异性细胞毒性
将SARS-CoV-2特异性CTL克隆重编程为iPSC并再分化为年轻化CTL（COVID19-rejTs）后，其细胞毒性功能得以保留。实验表明，COVID19-rejTs能有效裂解HLA匹配、刺突蛋白肽负载的LCL和表达CD19的NALM-6细胞，而对HLA不匹配的Raji细胞（即使负载肽段）或未负载肽段的HLA匹配细胞杀伤作用很弱。与原始的COVID19-CTL克隆相比，COVID19-rejTs的杀伤效力相当，证实了iPSC重编程和再分化过程未破坏其HLA限制性的抗原特异性杀伤能力。
3. 成功生成双抗原识别的1919-CARrejTs
将CD19-CAR导入源自HLA-A02:01限制性COVID19-CTL的iPSC（COVID19-iPSCs）中，再分化为T细胞，成功获得了1919-CARrejTs。流式细胞术分析显示，近100%的1919-CARrejTs同时表达CD19-CAR（通过mCherry检测）和刺突蛋白特异性TCR（通过HLA-A02:01/S269四聚体检测），实现了双抗原识别能力的均匀表达。相比之下，用相同CAR载体从外周血制备的传统CD19-CAR-T细胞，其CAR表达率约为53.2%，且几乎检测不到刺突蛋白特异性TCR。
4. 1919-CARrejTs展现出更强的细胞毒性与更低的耗竭表型
与传统的CD19-CAR-T细胞相比，1919-CARrejTs细胞内细胞毒性效应分子颗粒酶B和穿孔素的表达水平显著更高。同时，其T细胞耗竭标志物LAG-3、TIM-3和TIGIT的表达水平则明显降低。这些结果表明，iPSC介导的年轻化过程使1919-CARrejTs具备了更强的效应功能和更“年轻”、更不易耗竭的表型。
5. 双抗原识别在匹配的抗原呈递下增强即时效应功能
51Cr释放实验表明，当靶细胞同时表达CD19并负载刺突蛋白肽（即能同时被CAR和TCR识别）时，1919-CARrejTs对LCL和NALM-6细胞的杀伤能力强于传统CD19-CAR-T细胞。然而，当使用HLA不匹配的Raji细胞（仅能被CAR识别）时，两者的杀伤能力无显著差异。这证实了双抗原识别在靶细胞同时具备两种抗原时，能产生协同作用，放大即时的细胞毒效应。
6. 1919-CARrejTs在连续肿瘤再攻击中维持持久的肿瘤抑制
在模拟反复肿瘤暴露的连续再攻击实验模型中，传统CD19-CAR-T细胞随着攻击次数增加，肿瘤细胞逐渐生长失控。相反，1919-CARrejTs在整个实验期间（七轮攻击）均能有效抑制肿瘤，将肿瘤比例维持在5%以下。实验终点时，1919-CARrejTs的耗竭标志物TIM-3表达水平也显著低于传统CD19-CAR-T细胞。值得注意的是，无论是否有刺突蛋白肽的TCR刺激，1919-CARrejTs均能有效清除肿瘤细胞，表明其CAR介导的杀伤功能本身是强大且持久的。
7. TCR刺激比单纯的CAR刺激诱导更强的增殖反应
CFSE稀释增殖实验旨在区分TCR和CAR信号对增殖的影响。结果表明，当1919-CARrejTs与负载刺突蛋白肽、HLA匹配但不表达CD19的PANC-1细胞（仅提供TCR刺激）共培养时，出现了强烈的增殖。而当与仅表达CD19的NALM-6细胞（仅提供CAR刺激）共培养时，增殖水平有限。如果NALM-6细胞同时负载刺突蛋白肽（提供CAR+TCR双重刺激），则会诱导额外的增殖。这些结果说明，天然TCR的刺激能诱导比单独CAR信号更强的增殖反应，并且TCR信号可以与CAR信号产生叠加效应，共同促进细胞扩增。
讨论
本研究成功建立并验证了一种结合iPSC年轻化技术与双抗原识别概念的新型CAR-T平台，并创新性地将其与SARS-CoV-2 mRNA疫苗接种这一全球性卫生实践相结合，提出了一种“疫苗协同”策略。1919-CARrejTs不仅通过iPSC重编程获得了更年轻、更具功能性的表型（高效应分子、低耗竭标志物），还因保留了刺突蛋白特异性TCR而具备了被疫苗再刺激的潜力。
研究发现，TCR介导的信号与CAR信号在功能上并不等同。在诱导细胞增殖方面，HLA限制性的、抗原特异性的TCR刺激展现出比单独CAR刺激更强的效力。这表明，在双抗原识别CARrejTs中，CAR主要作为精确的肿瘤靶向模块，而TCR信号则可以作为一个强大的辅助性增殖与持久性信号。因此，通过接种SARS-CoV-2 mRNA疫苗，有望在患者体内选择性扩增并长期维持这些输入的治疗性T细胞，从而克服传统CAR-T疗法中持久性不足的核心挑战。
该平台还具有开发“现货型”疗法的潜力。针对常见的HLA分型，可以预先大规模生产来自健康供者的CARrejTs，在需要时即时使用，后续再通过疫苗接种进行体内加强。这对于亟需治疗但自体T细胞质量或数量不佳的患者尤其有意义。此外，对于免疫功能低下、有发生重症或持续性COVID-19风险的血液恶性肿瘤患者而言，使用具有新冠病毒特异性的治疗细胞，可能兼具抗肿瘤和抗感染的双重潜在获益。
综上所述，这项研究为增强CAR-T细胞疗法的疗效提供了一种创新的协同策略。它通过巧妙利用现有疫苗基础设施，将iPSC技术、双特异性T细胞工程和免疫接种有机结合，为下一代“可加强”的细胞免疫治疗提供了概念验证和新的发展方向。未来的研究需要在动物肿瘤模型中进一步验证该策略的体内效果，并推动其向临床转化。
