《Frontiers in Plant Science》：Nitrogen-fixing root nodules elicited by rhizobial potassium ion transporter Smkup1: senescence and autophagy
编辑推荐：
本研究通过构建根瘤菌钾离子转运蛋白Smkup1缺失突变体，揭示了细菌K+转运与宿主细胞衰老及自噬（Autophagy）途径的关联。突变未导致根瘤结构异常，但显著上调了宿主与根瘤菌的应激响应基因（如MtCP5、RPoE2），同时下调了自噬通路基因（如ATG8）的表达。蛋白质互作网络分析预测了正负自噬调节因子（如Beclin 1、NAC1、BAK1）与共生、程序性细胞死亡（PCD）及衰老的关联，为通过调控基因表达延长根瘤寿命和固氮过程提供了新视角。
引言
豆科植物的根瘤共生固氮是生物圈中固定氮的重要来源之一。根瘤菌（如苜蓿中华根瘤菌 Sinorhizobium meliloti）在根瘤感染细胞（symplast）中暂时定殖形成菌落，并利用宿主细胞资源，在诱导氮酶（nitrogenase）后开始固定大气中的氮。共生关系的终止，即“根瘤衰老”，表现为感染细胞的裂解。在细胞水平上，感染细胞的寿命相对较短（约3-6周），且根瘤对环境胁迫高度敏感。感染细胞寿命短的原因尚不完全清楚，可能与离子（如钾离子）平衡缺陷有关。钾（K+）是植物适应非生物胁迫的关键离子之一，对细胞的渗透状态和阴阳离子平衡至关重要。钾在细胞中的可利用性取决于膜两侧的钾转运和浓度。本研究旨在阐明宿主植物钾转运蛋白介导的钾转运与类菌体（bacteroids）内钾转运之间的相互依赖性，为此创建并分析了细菌钾离子转运蛋白 Smkup1的缺失突变体，并研究了根瘤衰老和自噬诱导过程中相关基因的表达变化，以识别共生终止的潜在机制。
材料与方法
研究使用截形苜蓿 (Medicago truncatula) Jemalong A17栽培品种，接种苜蓿中华根瘤菌 (Sinorhizobium meliloti) Sm2011菌株或其 Smkup1突变体。通过基因替换技术构建了 S. melilotiKup1转运蛋白的缺失突变体，并利用定量PCR（qPCR）验证了突变背景下的基因表达缺失。通过分光光度计测量了对照菌株和突变菌株在LB液体培养基中的生长动力学。种植8周后，测量了每株植物的根瘤重量。使用实时定量PCR（qPCR）分析了宿主植物和根瘤菌的应激响应基因（如 MtCP5、RPoE2）以及自噬通路基因（如 ATG1、ATG2、ATG8、ATG9）的表达水平。通过光学显微镜和电子显微镜分析了根瘤的解剖结构和超微结构。利用STRING数据库对自噬的正负调节因子（如Beclin 1、NAC1、BAK1）进行了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的 in silico分析。
结果
突变体 Smkup1的构建通过qPCR得到验证，突变背景中 kup1基因表达缺失。细菌生长动力学分析显示，与野生型对照菌株Sm2011相比，突变菌株在培养48小时和72小时后生长速率显著滞后。然而，突变并未对根瘤生长产生负面影响，接种8周后，突变体诱导的根瘤重量与野生型相比没有显著差异，也未观察到快速衰老的表型（如形成绿色的豆血红蛋白分解区）。细胞学分析表明，Smkup1突变体诱导的根瘤在组织学或解剖学上未显示明显缺陷，也未形成特定的早期衰老表型。电子显微镜观察显示，突变体与野生型诱导的根瘤在固氮区感染细胞的超微结构没有显著差异，未发现共生终止或微生物快速裂解消除的位点。固氮能力指示基因 NifH的表达在突变体和野生型诱导的根瘤中无显著差异。
为了评估突变诱导根瘤的胁迫水平，分析了微生物共生体和宿主胁迫及衰老相关基因的表达。结果表明，与野生型对照相比，突变体诱导的根瘤中细菌胁迫标记基因 RPoE2（一种包膜胁迫响应σ因子）的表达显著上调，表明根瘤菌处于胁迫状态。同时，宿主植物胁迫响应基因 MtCP5（一种半胱氨酸蛋白酶编码基因，作为根瘤衰老标记）的表达也显著上调，反映了宿主细胞的胁迫响应。
值得注意的是，与应激响应基因上调的趋势相反，自噬通路基因的表达在突变诱导的根瘤中显示出下调趋势。低水平表达的自噬基因 ATG1、ATG2和 ATG9的表达有下降趋势，而高水平表达的自噬基因 ATG8的表达在突变诱导的根瘤中出现了统计学上的显著下调。为了阐明根瘤发育过程中自噬调控的途径，利用Symbimix数据库 in situ分析了自噬调控基因在 M. truncatula根瘤不同发育区的表达水平。结果显示，自噬的正调控因子（如 Beclin1、SnF、WRKY20、Dhh1）在成熟的固氮区高表达，可能表明该区域存在能量限制。参与自噬体发育和成熟的基因（如 TGA9、WRKY24、WRKY33）在根瘤顶端区域表达。而自噬抑制基因（如 SOC1、PP2A、NAC1、TORC、BAK1）则在不同的根瘤区域上调表达，暗示存在发育阶段特异性的调控。
为了识别根瘤中自噬基因的潜在调控途径，对自噬的正负调控因子进行了蛋白质-蛋白质相互作用的 in silico分析。对自噬核心正调控因子Beclin-1的分析显示，其互作蛋白网络包括一个PI3K磷脂酰肌醇3-激酶（自噬相关蛋白）、酪氨酸激酶蛋白、钙依赖激酶蛋白、丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白、自噬相关蛋白3（ATG3）、参与细胞质到液泡运输的泛素样蛋白ATG12，以及一个紫外线辐射抗性相关蛋白。对负调控因子NAC1（一个NAC结构域转录因子）的分析显示，其互作蛋白主要涉及对生长素等激素的响应、氮缺乏以及对有机物质和化学物质的响应。值得注意的是，该网络中有多个蛋白与共生相互作用、细胞胁迫响应、程序性细胞死亡（PCD）和根瘤衰老相关，例如一个STAY-GREEN蛋白（MtSGR），它参与根瘤发育和衰老。对另一个负调控因子BAK1（一种BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1相关受体激酶1）的分析显示，其互作蛋白网络涉及激素（油菜素内酯、生长素）介导的信号通路调节、信号转导以及对含氧化合物的响应。特别的是，该网络中的多个蛋白参与了对细菌防御反应的负调控、细胞死亡的负调控以及植物-病原体互作。对正调控因子 Beclin1基因的表达分析显示，其在野生型菌株诱导的根瘤中的表达显著高于突变体诱导的根瘤。
讨论
在豆科-根瘤菌共生过程中，大量活细菌在根瘤细胞的共质体中维持数周，这对于任何真核生物来说都是极为罕见的现象。维持这种菌落会改变感染细胞的生物学特性，并可能是其寿命较短的原因之一。宿主细胞钾离子转运蛋白（如MtAKT1和MtSKOR/GORK）的错位导致感染细胞内钾含量降低，可能影响细胞稳态。本研究通过分析细菌钾离子转运蛋白 Smkup1的突变体，探讨了共生伙伴在根瘤钾转运中的作用。虽然该单基因突变未导致根瘤结构损伤或共生体的快速衰老，但在没有可见异常的情况下，根瘤表现出高水平的胁迫响应基因表达，同时自噬诱导相关的ATG基因表达下调。
自噬是细胞在能量缺乏、营养限制或存在微生物等不利条件下诱导的“管家”过程。一般认为，细菌进入真核细胞会触发保护性反应，表现为自噬过程的诱导。在动物病原体感染中，会形成细菌包含空泡（bacteria-containing vacuoles），其膜上标记有RAB家族小GTP酶（如RAB7、RAB24）和特定的多磷酸肌醇，以确定膜/细胞器身份和膜融合。这些空泡最终会与具有裂解特性的自噬体融合，该过程由RAB7 GTP酶和同型融合及蛋白分选复合体（HOPS）的效应蛋白VPS11和VPS15协调。有趣的是，根瘤中的共生体膜在结构上与细菌包含空泡有许多共同点，它们也招募小GTP酶RAB7和SNARE蛋白。然而，由于感染细胞中这些效应蛋白的表达被强烈下调，HOPS效应蛋白VPS11和VPS15向共生体膜的募集受到抑制，使得共生体暂时免受自溶。
本研究显示，自噬通路基因在根瘤所有区域都有表达，但在野生型根瘤的感染细胞中并未诊断到“经典形式”的自噬体。在 Smkup1突变体诱导的根瘤中，自噬清除过程更像是被抑制而非上调，这暗示即使在不利条件下，维持细菌菌落存在的可能性依然存在。尽管感染细胞可能处于糖水平不理想、钾等离子水平不足、低氧等次优状态，它仍能支持固氮细菌菌落长达6-8周，尽管这可能以牺牲其自身寿命为代价。
根据 in situ表达分析，自噬关键调控基因（如 Beclin1、SnF和 Dhh1）在根瘤固氮区高表达，暗示该区域存在饥饿环境以及自噬的诱导。特别有趣的是，参与自噬体成熟的基因 WRKY20在根瘤细胞中表达，尽管在这些细胞中从未发现过自噬体。自噬体膜的形成依赖于宿主膜，主要是内质网膜。值得注意的是，共生体膜也是由宿主细胞内质网形成的。如何调和解释根瘤中相对较高的自噬基因表达水平与细胞中“经典”自噬体的缺失，目前尚不清楚。根瘤中防止共生体自噬清除和诱导感染细胞死亡的机制也尚未明了。
我们可以假设，根瘤中的自噬调控可能至少部分依赖于蛋白质的构象而非基因。为了识别根瘤中自噬调控的潜在途径，我们基于已识别的自噬通路基因进行了蛋白质-蛋白质相互作用的 in silico分析。正调控因子Beclin1与参与自噬通路和细胞质到液泡运输的泛素样蛋白ATG12相关联，而这些过程在感染细胞中部分受到抑制。负调控因子NAC1的互作网络涉及程序性细胞死亡、胁迫响应以及调控根瘤发育和衰老的STAY-GREEN蛋白。负调控因子BAK1的互作网络则涉及对细菌防御反应的负调控和细胞死亡的负调控，其在防止共生细胞中细菌被清除方面的作用可能至关重要。
关于根瘤感染细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的数据，以及共生体形成与自噬体形成之间的某些相似性，使我们推测自噬通路可能被“征用”到共生形成过程中，并且该过程的调控在胁迫条件下可能非常重要。这可能暗示自噬基因在共生过程中发生了新功能化，可能参与了固氮共生体形成后的细胞内容纳后期阶段，并成为调控共生体维持的有用工具。本研究为通过调控这些基因的表达来延长根瘤寿命和固氮过程的持续时间提供了理论基础和新思路。
