基于AAV2/AAV6异源初免-加强免疫策略的新抗原癌症疫苗联合放疗诱导抗肿瘤免疫以抑制肿瘤生长与复发

《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Heterologous prime-boost immunization of AAV-based neoantigen cancer vaccine induces anti-tumor immunity to inhibit tumor growth and relapse

本综述重点探讨了一种新型工程化AAV（腺相关病毒）载体新抗原癌症疫苗平台。文章系统评估了该疫苗与局部放疗（RT）及免疫检查点阻断（ICB）联用，在多种弱免疫原性肿瘤模型（如MSS-CRC、TNBC和肺癌）中的协同疗效。研究发现，该组合疗法能显著增强CD8+T细胞浸润与功能，重塑肿瘤微环境（TME），并有效抑制远处转移。尤为突出的是，研究提出的AAV2/优化AAV6（oAAV6）异源初免-加强免疫策略，成功克服了载体特异性免疫（如预存中和抗体）的限制，放大了新抗原特异性免疫应答，为克服当前癌症疫苗的临床瓶颈提供了创新性解决方案。

　　

引言

免疫检查点阻断（ICB）疗法改变了癌症治疗格局，但其疗效高度依赖于肿瘤突变负荷（TMB）和肿瘤浸润淋巴细胞的存在，对于微卫星稳定结直肠癌（MSS-CRC）、三阴性乳腺癌（TNBC）等弱免疫原性肿瘤效果有限。治疗性癌症疫苗通过诱导肿瘤特异性CD8⁺T细胞，为克服ICB耐药提供了有前景的策略。腺相关病毒（AAV）载体因其良好的安全性和可工程化特性，在疫苗递送领域备受关注。AAV6血清型能直接靶向抗原呈递细胞（APCs），增强抗原呈递。然而，基于AAV的疫苗面临预存免疫和疫苗诱导的载体特异性免疫（如中和抗体）的限制。新抗原（neoAg）疫苗能激发特异性T细胞反应，并与ICB产生协同作用。本研究在前期开发的工程化AAV2新抗原疫苗（AAVax）基础上，深入探讨其与放疗、ICB联用的疗效，并创新性地提出AAV2/AAV6异源初免-加强策略以突破免疫限制。

结果

AAV2癌症疫苗联合放疗与ICB在弱免疫原性CRC和TNBC中抑制肿瘤生长

在MSS-CRC（CT26）和TNBC（4T1）小鼠模型中，评估了AAVax联合局部放疗（8 Gy × 3）和抗PD-1抗体的疗效。在CT26模型中，AAVax单独给药可轻微延缓肿瘤生长，但与放疗联用（AAVax/RT）或三者联用（AAVax/RT/抗PD-1）能显著缩小肿瘤体积，并分别达到33.33%和66.67%的完全缓解（CR）率。肿瘤组织分析显示，联合治疗组中肿瘤浸润CD3⁺、颗粒酶B（GzmB）⁺T细胞以及GzmB⁺CD8⁺T细胞密度显著增加。在4T1模型中观察到类似结果，联合疗法增强了ICB反应和T细胞浸润。更重要的是，AAVax/RT/抗PD-1联合治疗显著降低了自发肺转移和肝转移的发生风险，表明其能有效抑制远处转移。

新抗原疫苗联合放疗协同增强肺癌对ICB的反应

在ASB-XIV小鼠肺癌模型中，通过全外显子组测序（WES）和RNA测序（RNA-seq）筛选出9个潜在新抗原，构建了AAVax-ASB疫苗。治疗结果显示，AAVax-ASB显著延缓肿瘤生长，与放疗联用可诱导16.67%的CR率，而三联疗法（AAVax-ASB/RT/抗PD-1）将CR率提升至约66.67%。流式细胞术分析表明，三联疗法显著增加了肿瘤内CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞（TILs）的浸润，并扩增了效应记忆CD4⁺和CD8⁺T细胞亚群。同时，细胞毒性IFNγ⁺CD8⁺T细胞、CD3⁺、GzmB⁺及GzmB⁺CD8⁺T细胞频率均显著升高。此外，联合治疗组中CD8⁺TILs上的耗竭标志物PD-1表达显著降低。这些结果表明AAVax-ASB疫苗能有效触发T细胞反应，增强肺癌对ICB的敏感性。

异源AAV2/oAAV6初免-加强策略规避载体免疫并增强新抗原特异性T细胞反应

为克服AAV2载体特异性免疫（如中和抗体）的限制，研究优化了AAV6载体。构建了包括S663V、T492V/S663V以及T492V/S663V/I585-RGD（优化AAV6， oAAV6）在内的多种修饰AAV6衣壳。体外实验显示，三重修饰的oAAV6在树突状细胞（DCs）中具有更优的转导效率，并能显著上调DCs成熟标志物CD80和CD86。在肺癌模型中，比较了同源（AAV2/AAV2）与异源（AAV2/AAV6， AAV2/oAAV6）初免-加强策略。AAV2/oAAV6异源疫苗接种显示出更强的肿瘤消退效果，并显著增加了肿瘤内CD11c⁺DCs和CD3⁺T细胞的浸润。流式分析进一步证实，AAV2/oAAV6组中肿瘤内CD8⁺TILs、效应记忆CD8⁺T细胞（T_EM）以及细胞毒性标志物GzmB和IFNγ阳性的CD8⁺T细胞频率均显著升高。T细胞受体（TCR）测序分析显示，异源接种后TCR多样性降低，优势克隆富集，表明产生了聚焦的新抗原特异性T细胞反应。ELISPOT实验证实，针对特异性新抗原肽（如mPhf3和mGlud1）的T细胞反应增强。重要的是，异源AAV2/oAAV6策略显著降低了血清中抗AAV2中和抗体的水平，成功规避了同源接种引发的载体免疫限制。

异源AAV2/oAAV6新抗原疫苗接种联合放疗引发系统性抗肿瘤免疫以清除远处肿瘤

在双侧荷瘤（ASB-XIV）小鼠模型中，评估异源接种联合放疗能否引发系统性（远隔）抗肿瘤效应。对一侧（原发）肿瘤进行局部放疗，并给予AAV2初免和AAV6或oAAV6加强。结果显示，AAV2/oAAV6联合放疗组在原发肿瘤中实现了约66.7%的CR率，显著高于AAV2/AAV6联合放疗组（33.3%）。尤为关键的是，未经照射的对侧（远隔）肿瘤体积也显著缩小。机制上，联合治疗显著增加了肿瘤内CD11c⁺DCs和CD3⁺T细胞的浸润，并提升了成熟CD86^Hi和CD80^HiDCs的频率。转录组分析和流式细胞术证实，NK细胞和T细胞显著富集，且细胞毒性IFNγ⁺CD8⁺和GzmB⁺CD8⁺TILs数量增加。来自联合治疗组小鼠的脾脏T细胞在体外对ASB-XIV癌细胞表现出更强的杀伤能力。这些结果证明，AAV2/oAAV6异源疫苗接种联合放疗能重塑肿瘤微环境，激发强大的系统性T细胞免疫，从而有效清除远处肿瘤细胞。

讨论

癌症疫苗是诱导新抗原特异性T细胞免疫的有效手段。本研究证实，工程化AAV2新抗原疫苗平台与放疗及ICB联用，能有效克服弱免疫原性肿瘤的ICB耐药，重塑肿瘤微环境。研究的主要创新在于提出了AAV2/优化AAV6（oAAV6）的异源初免-加强免疫策略。oAAV6通过衣壳修饰（T492V/S663V/I585-RGD）增强了DC靶向性和转导效率。该策略不仅放大了新抗原特异性CD8⁺T细胞反应，还成功规避了因预存或治疗诱导的抗AAV2中和抗体所导致的疫苗效力衰减问题。这与近年来其他利用腺病毒、李斯特菌等平台的异源接种研究结论一致，均显示出优于同源策略的免疫效果。然而，新抗原特异性T细胞本身往往不足以完全清除肿瘤。本研究突出表明，AAV2/oAAV6疫苗接种与放疗联用产生了强大的协同效应，显著增加了细胞毒性IFNγ⁺CD8⁺和GzmB⁺CD8⁺T细胞，这对于克服免疫抑制性肿瘤微环境、清除远处未照射的肿瘤细胞至关重要。

材料与方法

研究使用6周龄雌性BALB/c小鼠。细胞系包括CT26、4T1、ASB-XIV和293T等，均按标准方法培养并检测支原体。AAV载体通过三重转染293T细胞制备并纯化，滴度通过qPCR测定。通过WES和RNA-seq筛选ASB-XIV的新抗原，并使用NetMHCpan算法预测MHC-I结合肽。体外通过LPS刺激RAW264.7细胞或使用GM-CSF和IL-4培养骨髓细胞来获得树突状细胞。体内肿瘤实验在小鼠皮下接种肿瘤细胞后进行，当肿瘤体积达到约70-100 mm³时开始治疗。治疗方案包括肌肉注射AAV疫苗（1×10⁸vg/剂）、局部放疗（8 Gy × 3）和腹腔注射抗PD-1抗体（100 μg/鼠）。肿瘤体积定期测量，终点时收集组织进行流式细胞术、免疫荧光、TCR测序、ELISPOT等分析。所有动物实验均遵循相关伦理指南。