《Frontiers in Microbiology》：Non-targeted metabolomics reveals metabolic signatures associated with Clostridioides difficile virulence
1 引言
艰难梭菌（Clostridioides difficile）是引起医院获得性腹泻和伪膜性结肠炎的重要病原菌。传统上，其致病机制主要聚焦于其产生的两种主要毒素TcdA和TcdB。然而，毒素水平本身无法完全解释不同菌株间显著的毒力差异，表明除毒素外，菌株特异的生物学特性、代谢能力、孢子形成、粘附/定植能力以及与宿主微生物组的相互作用等，可能也是决定毒力变异的关键因素。
近年研究表明，艰难梭菌在肠道生态位中获取营养物质的能力、代谢适应性及底物利用谱，直接影响其定植成功、孢子萌发、毒素表达以及与宿主/微生物群的竞争优势。特别是，该菌能够发酵支链氨基酸并利用中央碳代谢的替代途径（如丙酮酸和乙酰辅酶A），从而在抗生素破坏微生物群后的肠道生态系统中获得代谢优势。同时，来自宿主或共生菌的代谢底物（如胆汁酸、糖醇、粘蛋白降解产物）已被证明是艰难梭菌定植和增殖的关键营养来源，表明其代谢适应与宿主-微生物群相互作用密切相关。近期研究表明，有毒力与无毒力菌株之间存在显著的代谢差异：高毒力菌株可能激活氨基酸发酵途径、有机酸产生途径甚至脂质代谢重塑，而非毒力菌株可能在代谢活性或底物利用上存在局限。
尽管如此，对于不同毒力艰难梭菌菌株在纯培养条件下的代谢组学变化研究仍然缺乏，特别是从非靶向代谢组学的角度，系统阐明菌株间底物利用谱、代谢物积累及其与毒力表达的相关性尚待深入。因此，本研究旨在利用非靶向代谢组学方法比较不同核糖体型/序列型临床分离株的代谢产物。研究选择了四个核糖体型/序列型谱系，因为它们代表了临床上和流行病学上已确立的毒力梯度，从高毒力的RT027/ST1谱系到相对低毒力的RT012/ST54谱系，RT046/ST35和RT017/ST37则处于中间位置。
2 材料与方法
2.1 样品与收集
本研究使用的艰难梭菌菌株来自先前获得的临床分离株库。该菌株库最初来源于2016年3月至2017年4月在淄博市中心医院和青岛大学附属医院进行的一项多中心流行病学研究，共收集了504份非重复性CDI（艰难梭菌感染）患者粪便样本。基于此库，筛选出代表四个主要核糖体型/序列型谱系（RT027/ST1、RT046/ST35、RT017/ST37和RT012/ST54）的分离株用于当前的代谢组学实验。
2.2 艰难梭菌的培养与鉴定
粪便样本接种于ChromID艰难梭菌琼脂平板，并在37°C厌氧条件下孵育48小时。典型的艰难梭菌菌落随后使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和VITEK MS系统进行鉴定。
2.3 多位点序列分型和PCR核糖体分型
多位点序列分型（MLST）使用七个基因位点进行。PCR产物纯化后在北京泰和生物技术公司进行测序。将DNA序列与PubMLST数据库进行比对以获得等位基因编号、序列型（ST）和进化枝。PCR核糖体分型通过毛细管凝胶电泳进行。使用Gene Marker V2.2.0确定每个峰的大小，并通过WEBRIBO数据库呈现数据并分配核糖体型。
2.4 细菌代谢组样品的提取与处理
对四种艰难梭菌菌株的细菌细胞进行代谢组学分析，采用液相色谱-质谱联用技术。经过48小时厌氧生长后，离心收集细菌沉淀以提取代谢物。
细菌沉淀在4°C短暂解冻，加入200μL预冷的超纯水和800μL预冷的甲醇进行提取。样品充分涡旋，并在冰浴中进行超声破碎20分钟。通过-20°C孵育1小时实现蛋白质沉淀，随后在4°C、16000g条件下离心20分钟。收集上清液用于代谢物分析。
剩余的蛋白质沉淀风干后，用200μL SDT裂解缓冲液重悬，并使用BCA法测定细菌总生物量。根据蛋白质含量，将等体积的含代谢物上清液真空浓缩干燥。在进行LC-MS分析前，将干燥的提取物用40μL甲醇-水溶液重悬，并在4°C、20000g条件下离心20分钟。最终的上清液用于后续LC-MS进样分析。
2.5 样品分组与统计分析
在代谢组学分析中，每个序列型作为一个独立的临床分离株进行分析，并设有生物学重复。LC-MS分析对每个分离株独立进行。为了进行多元分析，使用MetaboAnalyst 6.0对归一化峰强度矩阵进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。使用Spearman相关分析筛选在预定义毒力梯度（ST54-ST35/ST37-ST1）中表达存在差异的代谢物，并通过倍数变化进行过滤。
相关性系数ρ > 0.6且P > 0.05的代谢物被视为与毒力增加或减少显著相关。在必要时应用Benjamini–Hochberg校正进行错误发现率（FDR）校正以控制多重检验。对于两两比较，使用单因素方差分析和事后检验评估统计学显著性。数据以均值±标准差表示。
2.6 液相色谱-质谱分析条件
代谢组学检测平台使用岛津Nexera X2超高效液相色谱系统与AB Sciex Triple TOF 6600高分辨质谱仪联用。色谱柱采用Waters ACQUITY UPLC?HSS T3柱。质谱分析在正离子模式下进行，扫描范围设置为m/z 50–1,000。MS/MS谱图使用数据依赖性采集模式获取。
2.7 数据处理与代谢物鉴定
原始质谱数据使用MS-DIAL软件进行峰提取、保留时间校正和峰面积归一化。基于MS/MS碎片信息进行代谢物鉴定，并参考HMDB、KEGG和MassBank等公共数据库进行比较和筛选。为确保数据质量，在整个过程中加入空白对照和混合QC样本，用于质量控制和仪器稳定性监测。
2.8 统计分析
使用单因素方差分析结合事后多重比较检验来鉴定菌株间的差异代谢物。P值使用Benjamini–Hochberg错误发现率进行校正。FDR校正后P < 0.05的代谢物被认为具有统计学显著性。
3 结果
3.1 代谢谱的建立与评估
本研究采用LC-MS非靶向代谢组学技术分析了四种艰难梭菌菌株的代谢物。质量控制验证显示QC样本在正/负离子模式下具有高度一致性，表明仪器性能稳定。多元统计分析揭示了四种菌株间代谢物谱的显著差异。在正离子模式下，PCA得分图显示四组间存在清晰的分离趋势，主成分1和主成分2分别贡献了31.20%和14.97%的方差。这种自然聚类趋势在监督性的PLS-DA模型中得到了进一步验证和强化，显示出优异的组间分离，表明菌株具有独特的代谢表型特征。在负离子模式下，PCA和PLS-DA模型同样显示出显著的组间分离趋势。这一趋势与正离子模式分析结果一致，证实了不同核糖体型和序列型的艰难梭菌菌株在其内在代谢物组成上存在根本性差异。总之，质量控制系统表现出优异的稳定性，多元统计模型清晰地揭示了ST1、ST35、ST37和ST54菌株代谢谱的整体差异，表明本研究获得的代谢组学数据可靠，适用于后续差异代谢物筛选和通路分析。
3.2 代谢物分类与通路分布
本研究在非靶向代谢组学分析中共鉴定出3,255种代谢物，其中正离子模式检测到1,735种，负离子模式检测到1,520种。在正离子模式下，羧酸及其衍生物以及异戊二烯类化合物占比最高，其次是类固醇衍生物及其类似物。在负离子模式下，类固醇及其衍生物构成最大类别，其次是羧酸及其衍生物。KEGG代谢通路富集分析（TOP30）显示，正离子模式结果突出了脂质代谢和细胞膜重塑，而负离子模式则强调了碳水化合物摄取和细胞壁碳水化合物代谢。这些通路将在讨论部分结合毒力相关的代谢重编程进行解读。
3.3 差异代谢物筛选与鉴定
火山图和热图直观展示了正负离子模式下不同菌株间的差异代谢物。
差异代谢物筛选结果显示，在ST1与ST54的正离子模式比较中，鉴定出70个显著差异代谢物，包括16个上调和54个下调的代谢物。比较ST1与ST35揭示了45个差异代谢物：33个上调和12个下调。比较ST1与ST37鉴定出66个差异代谢物：23个上调和43个下调。在负离子模式下，同样观察到显著的组间差异，其中ST1与ST54之间检测到的差异最丰富，揭示了73种差异代谢化合物（13个上调和60个下调）。
差异代谢物的代谢通路富集分析显示，正离子模式主要突出了脂质代谢和细胞膜结构重塑，表明膜结构和信号传导可能是毒力差异的关键因素。负离子模式则强调了碳水化合物摄取和利用以及细胞壁碳水化合物代谢，表明不同血清型在能量代谢和细胞壁结构组装方面存在显著差异。烟酸和烟酰胺代谢通路的共同富集表明，能量代谢重编程可能是维持不同毒力水平的基础。
3.4 与毒力梯度相关的差异表达代谢物的筛选及功能富集分析
基于已发表的流行病学数据、实验感染模型以及原始患者分离株的临床严重程度评分，将四种菌株归入预定义的毒力等级：ST1为高毒力谱系，ST35和ST37为中等毒力谱系，ST54为低毒力谱系。所有提及“毒力增加”的分析均遵循此特定排序：ST54→ST35/ST37→ST1。
利用四种处于既定毒力梯度内的艰难梭菌菌株的非靶向代谢组学数据，确定了正负离子模式下随着毒力增加而逐步上调和下调的代谢物。值得注意的是，代谢物的变化在所有菌株中并非均质，而是与其相对毒力水平呈单调模式。例如，有机酸、类固醇、三萜类以及能量相关代谢物随着从低毒力ST54到中等毒力ST35和ST37，再到高毒力ST1的过程而逐渐增加。这一趋势表明，与能量代谢、膜脂质代谢和应激防御相关的通路激活程度随着菌株毒力增加而上调，这可能为高毒力菌株提供了更高的生物合成能力和环境适应性。
相反，包括核苷及其衍生物、细胞壁前体、胆汁酸代谢物和各种生物碱在内的48种代谢物，从ST54到ST1呈阶梯式下降。这种沿毒力梯度的协调性下调可能反映了高毒力菌株中细胞壁生物合成和核苷酸代谢受到抑制，表明代谢资源被重新分配以支持快速生长、毒素产生和应激抵抗。
通过整合Metaboanalyst 6.0和KEGG等数据库，我们进一步筛选出13个与CDI毒力梯度相关且生物学意义最高的潜在生物标志物。其中上调的包括：异芒果苷、人参皂苷Ro、甘氨胆酸、乳酸、5-氨基戊酸、异戊酸、异丁酸和α-氨基丁酸；下调的化合物包括：肌苷、甘氨熊去氧胆酸、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰葡糖胺和胆固醇。这些毒力相关趋势在菌株间的变化已可视化。
根据MetaboAnalyst 6.0数据库，上述13个差异表达代谢物主要富集在以下通路：初级胆汁酸生物合成、丙酮酸代谢、糖酵解或糖异生、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、类固醇生物合成、氨基糖和核苷酸糖代谢、嘌呤代谢以及类固醇激素生物合成。
4 讨论
4.1 胆汁酸代谢重编程与毒力调控
我们检测到随着菌株毒力增加，甘氨胆酸显著上调，而甘氨熊去氧胆酸下调，这表明毒力菌株间胆汁酸组成的差异可能与孢子萌发和致病潜力密切相关。先前研究表明，初级胆汁酸如牛磺胆酸盐和胆酸盐可显著诱导艰难梭菌孢子萌发，而某些次级胆汁酸或结合形式如鹅去氧胆酸盐则是有效的竞争性抑制剂，可抑制牛磺胆酸盐诱导的萌发并降低菌株的毒力表达。其他研究也表明，不同菌株对次级胆汁酸的敏感性不同，这些差异与菌株毒力和肠道定植能力相关。因此，我们假设在高毒力菌株中，对初级胆汁酸的生物合成或耐受机制增强，而次级或结合胆汁酸的产生或作用减弱。这种胆汁酸重塑可能使这些菌株在宿主体内孢子萌发和早期增殖阶段获得优势。
4.2 发酵代谢与能量代谢重编程
本研究中，随着菌株毒力增加，包括乳酸、异戊酸、异丁酸和α-氨基丁酸在内的发酵代谢物持续上调。这表明这些菌株可能加速或增强氨基酸发酵和短链/支链脂肪酸的产生，以满足其高代谢需求和毒素合成要求。先前文献表明，外源性短链脂肪酸（SCFAs）如丁酸盐在环境中抑制艰难梭菌生长，同时促进孢子形成和毒素释放，显示了SCFAs在调节菌株存活和毒力方面的双重作用。同时，综述表明SCFA水平和肠道代谢环境的改变通常与CDI严重程度呈负相关。高浓度SCFA可能抑制菌株增殖，但可能驱动毒力基因表达以对抗竞争压力。基于我们的发现，此类发酵产物的上调可能不仅反映了在资源有限或竞争条件下代谢资源的重新分配，还可能触发了与毒力相关的调节通路。
4.3 膜脂重排与细胞壁前体代谢
我们的结果表明高毒力菌株中膜脂相关代谢活性增强，同时细胞壁前体如N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺下调。这表明膜结构合成和细胞壁合成之间可能存在代谢权衡。近期一项研究发现，关键糖脂的合成酶UgtA和UgtB主导了艰难梭菌的膜脂组成。约50%的膜极性脂质是糖脂，这一比例远高于许多其他细菌，表明膜脂结构对艰难梭菌的生存和致病性具有特殊重要性。细胞壁前体合成途径在细菌生长、形态维持和宿主免疫逃避中起着关键作用。先前研究表明，当细胞壁合成被抑制或资源被转移到其他代谢或毒力相关过程时，细菌细胞壁完整性和分泌系统功能可能受损。根据我们观察到的下调趋势，我们假设高毒力菌株可能抑制或稀释细胞壁合成途径中的中间产物，同时重新配置膜脂以优化分泌系统或膜蛋白定位，从而促进毒素分泌、粘附或免疫逃避。
4.4 烟酸/烟酰胺代谢与氧化还原状态
NAD+是多种脱氢酶和氧化还原反应的关键辅酶。其可用性影响细菌在氧化代谢和发酵之间的代谢途径选择，直接影响生物能量学、应激反应和次级代谢能力。在艰难梭菌中，氧化还原调节蛋白及相关代谢途径已被证明与NAD+再生、发酵代谢和毒素产生相关联。因此，烟酸/烟酰胺代谢的改变为理解高毒力菌株如何在代谢水平上调控毒力提供了合理的分子机制。
4.5 候选标志物的潜力与应用前景
本研究确定的13种代谢物涉及胆汁酸、短链和支链脂肪酸、膜脂和细胞壁前体等多种通路。它们沿毒力梯度的一致变化表明这些代谢物有潜力作为艰难梭菌毒力分型的标志物。胆汁酸代谢与艰难梭菌孢子萌发和生长密切相关。初级胆汁酸如牛磺胆酸盐诱导萌发，而次级胆汁酸如脱氧胆酸盐和石胆酸盐则具有抑制作用。短链脂肪酸（SCFAs）如丁酸盐和异戊酸不仅影响能量代谢，还调节毒素表达和孢子形成。此外，细胞膜脂质组成和细胞壁前体代谢的改变可影响膜蛋白定位、分泌系统效率和对宿主防御的耐受性，从而改变毒力水平。这些发现表明，毒力增加可能伴随着能量分配和膜结构重塑的重编程。未来的研究可以通过靶向LC-MS/MS定量、动物模型和临床样本验证这些代谢物的诊断价值，同时利用ROC曲线和机器学习模型评估其分型或预测能力。
4.6 类固醇生物合成与含硫氨基酸代谢
除了胆汁酸和能量代谢外，半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及类固醇生物合成也在通路富集分析中被确定为与毒力相关的代谢程序。半胱氨酸和蛋氨酸代谢是氧化还原稳态、甲基转移和依赖硫的酶功能的关键，这对厌氧细菌的发育和应激耐受机制极为重要。硫氨基酸代谢通量的增强可能有助于谷胱甘肽、S-腺苷甲硫氨酸和其他辅因子的产生，从而提高对氧化应激的耐受性并调节毒力基因表达。
类固醇生物合成是一种宿主相关通路，与肠道中细菌对甾醇和胆汁酸衍生物的底物改变和利用密切相关。宿主酶将胆固醇衍生的类固醇合成胆汁酸，然后通过细菌代谢过程进行改变。因此，高毒力菌株中类固醇相关代谢物的生物合成增强与胆汁酸池的重塑一致，也可能有助于增加初级胆汁酸衍生物的可用性，从而促进孢子萌发和生长。这种代谢联系为本研究中发现的类固醇相关代谢物与毒力相关的胆汁酸标志物之间提供了机制上的联系。
4.7 四种艰难梭菌谱系的临床与生物学背景
RT027/ST1属于进化枝2，被广泛认为是高毒力谱系。它反复与毒素A和B产量增加、二元毒素CDT的存在、孢子形成增强以及CDI患者复发率、并发症发生率和死亡率升高相关。临床队列研究和实验感染模型均表明，与大多数其他谱系相比，ST1菌株表现出更优越的定植、持久性和致病性。
相比之下，RT012/ST54通常被认为是低毒力谱系。ST54的临床分离株与较轻的疾病、较低的毒素活性和宿主组织中较弱的炎症反应相关，并且经常从病情较轻的CDI患者中分离到。
RT046/ST35和RT017/ST37代表中等毒力谱系。这些菌株通常在临床队列中表现出中等的毒素产量、孢子形成能力和疾病严重程度，处于ST1和ST54所代表的极端情况之间。在本研究所用菌株最初分离的中国山东省的流行病学研究中，ST35和ST37与中等临床严重程度评分相关，而ST1显示出最高的严重程度，ST54则最低。
因此，本研究中分析的四种菌株代表了一个在生物学和临床上已验证的毒力梯度（ST1 > ST35 ≈ ST37 > ST54），而非随意排序。本文鉴定的代谢组学差异因此可以解释为这些已确立的菌株特异性毒力表型的分子相关性。
4.8 局限性与未来方向
本研究的主要目的是在受控和标准化的条件下，描述具有不同毒力背景的艰难梭菌分离株内在的、菌株特异的代谢多样性。因此，我们有意选择体外代谢组学平台，以减少宿主因素的影响，并允许更直接地比较细菌的代谢表型。
尽管体外培养条件允许控制菌株和生长环境，但这同时也意味着缺乏宿主因素以及肠道内实际胆汁酸池和营养竞争环境的复杂性。此外，宿主和微生物群产生的胆汁盐水解酶（BSHs）和其他胆汁酸修饰酶可能在体内显著塑造胆汁酸谱，
