《Frontiers in Immunology》：A 7-gene expression signature predicts immune microenvironment remodeling and neoadjuvant chemo-immunotherapy response in lung squamous cell carcinoma
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本文聚焦于肺鳞状细胞癌（LUSC）新辅助化疗免疫治疗（NCI）中的耐药难题。研究通过RNA测序（RNA-seq）分析治疗前后样本，揭示NCI能促使治疗反应良好（MPR）患者的肿瘤免疫微环境（TME）从“冷”转为“热”表型。研究者筛选出一个由HOXC13等7个基因组成的表达特征，与不良治疗反应相关，并在外部数据集中验证了其预测价值，为LUSC患者分层和克服免疫治疗耐药提供了新的潜在生物标志物与策略。
引言
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，肺鳞状细胞癌（LUSC）是其第二常见亚型，约占总数的20%至30%。对于可切除的晚期LUSC，手术仍是治疗基石，但其可切除率较低且术后易复发。鉴于LUSC中可靶向的致癌突变较少，新辅助化疗免疫疗法（NCI）已成为主要的术前治疗策略。尽管NCI改善了患者预后，但部分患者仍然耐药，其机制尚不清楚。免疫治疗主要靶向免疫微环境而非肿瘤细胞本身，旨在逆转免疫抑制的微环境。本研究旨在通过分析NCI治疗前后成对肿瘤样本的转录组变化，探索与治疗反应相关的免疫微环境重塑和预测生物标志物。
方法
研究连续纳入了2020年至2022年间在上海肺科医院接受NCI治疗的40例IIB-IIIC期LUSC患者。所有患者在接受2-4个周期的PD-1抗体联合化疗后接受手术。根据术后病理评估，将患者分为主要病理缓解（MPR）组（30例，75%）和非MPR组（10例，25%）。收集治疗前（活检）和治疗后（手术切除）的配对肿瘤样本，进行批量RNA测序（RNA-seq）。通过CIBERSORT算法和基于单细胞研究衍生的134种免疫细胞类型标记物进行免疫细胞富集分析。使用加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别与“冷”和“热”肿瘤表型相关的基因模块。生存分析使用Kaplan-Meier法和log-rank检验，并在OAK临床试验数据集中进行外部验证。
结果：NCI后MPR患者免疫浸润显著增加
转录组测序和信号通路富集分析显示，在MPR组患者中，NCI治疗后与免疫应答和抗肿瘤效应相关的多种通路（如异体移植排斥、补体系统、炎症反应等）显著上调。相反，在非MPR组中，治疗后上调的通路较少，主要涉及肌生成、上皮-间质转化和凝血途径等。进一步分析134种免疫细胞亚型的富集评分发现，在MPR组中，多种免疫细胞相关特征（如未成熟B细胞、活化B细胞、效应记忆CD8+T细胞、自然杀伤T细胞等）在NCI后显著增加；而在非MPR组中，未观察到显著的免疫细胞富集变化。治疗后，MPR肿瘤显示出比非MPR肿瘤更高的抗肿瘤免疫活性。这些结果表明，NCI在应答者中引发了强有力的适应性免疫激活，而在无应答者中，免疫重塑则受到抑制。
基于免疫微环境聚类识别与治疗反应相关的“热”和“冷”肿瘤
通过对治疗前后样本的RNA-seq和免疫微环境聚类分析，可以将样本区分为“冷”和“热”表型。治疗后，根据肿瘤免疫微环境（TME）特征，可将样本分为四个亚群。其中，簇1（C1）和簇2（C2）因T细胞和NK细胞富集评分较高而被归类为“热”肿瘤；簇3（C3）和簇4（C4）因B细胞和树突状细胞富集评分较低而被定义为“冷”肿瘤。桑基图分析显示，近一半的“冷”肿瘤在NCI后转化为“热”肿瘤。治疗后，96.4%的MPR患者处于“热”肿瘤簇，而75%的非MPR患者仍停留在“冷”肿瘤簇，强调了“热”表型与良好治疗反应之间的关联。
鉴定与NCI疗效相关的7个基因
为探索与NCI疗效相关的基因，研究者比较了从“热”转为“冷”（HC）和保持“冷”（CC）状态的肿瘤之间的差异表达基因（DEGs），并结合WGCNA模块分析和单因素逻辑回归。最终，三个数据集的交集确定了7个与NCI疗效相关的基因：TNNT1、FOXL2、LMX1B、NEFL、HOXC13、ASS1和KLK11。这7个基因在非MPR组中的表达显著高于MPR组。以这7个基因的平均表达建立的模型，在预测非MPR状态时显示出良好的诊断效能（AUC = 0.837）。相关性分析显示，这些基因的表达与多种免疫细胞类型的动态变化存在显著关联，例如HOXC13与大多数免疫细胞的富集变化呈负相关。
在公共数据库验证7个基因表达水平与免疫治疗效果的相关性
在包含10例可切除II-III期LUSC患者的独立新辅助队列中，基于7个基因高表达定义的高风险组MPR率远低于低风险组。进一步，利用III期OAK临床试验数据的验证发现，在LUSC免疫治疗组中，高基因表达的患者比低基因表达患者具有更短的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。然而，在LUSC化疗组中，这7个基因的表达并不影响患者的OS和PFS。这表明这7个基因的表达与免疫治疗效果相关，高表达可能降低疗效，且可能作为LUSC特异性免疫治疗生物标志物。其中，HOXC13与OS显著相关，并与PFS有相关趋势。
讨论与结论
本研究发现，在MPR患者中，NCI治疗能将肿瘤免疫微环境从“冷”表型重塑为“热”表型，显著增加抗肿瘤免疫细胞的浸润。而在非MPR患者中，这种免疫重塑则不明显。通过整合分析，研究筛选出一个由7个基因（TNNT1、FOXL2、LMX1B、NEFL、HOXC13、ASS1和KLK11）组成的表达特征，该特征与不良的NCI反应相关，并在外部数据集中验证了其预测价值。其中，HOXC13被证实与免疫细胞浸润减少和较差的免疫治疗效果相关。这些发现为理解LUSC的NCI耐药机制提供了新见解，并提示该7基因特征和HOXC13等关键因子有潜力作为预测LUSC患者NCI疗效的生物标志物，为临床克服免疫治疗耐药提供了潜在策略。
