《Frontiers in Immunology》：Ziyuglycoside II ameliorates chemotherapy-induced neutropenia by promoting neutrophil differentiation and functional recovery via SPI1 and C/EBP? transcriptional regulation
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本文研究表明，来源于中药地榆（Sanguisorba officinalis）的生物活性成分Ziyuglycoside II (ZGSII)，通过靶向转录因子SPI1和C/EBP?，有效促进中性粒细胞分化、成熟并恢复其吞噬和ROS生成等功能，显著改善了环磷酰胺（CY）诱导的中性粒细胞减少症（CIN）模型小鼠的骨髓抑制和生存率。其作用机制不同于传统G-CSF疗法，为CIN的临床治疗提供了新的潜在治疗策略。
3.1 ZGSII可减轻环磷酰胺诱导的中性粒细胞减少症和骨髓抑制
为评估ZGSII对化疗所致中性粒细胞减少症（CIN）的治疗效果，研究人员建立环磷酰胺（CY）诱导的小鼠CIN模型，并分别给予ZGSII（12 mg/kg/天，5天）或阳性对照药物重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF，40 μg/kg/天，4天）。血细胞计数分析显示，CY给药后第2天和第4天，白细胞、中性粒细胞等显著减少，成功诱导了白细胞减少症和中性粒细胞减少症模型。G-CSF治疗从第4天起显著升高白细胞和中性粒细胞计数，而ZGSII诱导了更渐进性的恢复，到第6天时，与CY模型组相比，白细胞和中性粒细胞计数分别升高了1.6倍和1.7倍。此外，ZGSII还促进了单核细胞计数的逐渐恢复，但对淋巴细胞或红细胞水平影响不显著。组织学分析表明，ZGSII和G-CSF均能显著改善骨髓组织细胞构成。与G-CSF引起明显脾肿大不同，ZGSII对胸腺和脾脏指数无显著影响，提示其安全性更好。
3.2 ZGSII促进中性粒细胞重建而不引起过度骨髓动员
为探究ZGSII对中性粒细胞发育的影响，研究人员利用流式细胞术分析了小鼠骨髓中中性粒细胞亚群的变化。结果显示，CY处理在诱导后两天内显著降低了不成熟中性粒细胞的比例，同时增加了成熟中性粒细胞的比例，提示CY诱导的骨髓抑制可能同时刺激了紧急粒细胞生成。从第2天到第4天，G-CSF显著扩增了不成熟中性粒细胞池，而ZGSII诱导的反应则更为温和。到第6天，ZGSII和G-CSF处理组的总体中性粒细胞水平均超过了基线值。值得注意的是，CY处理小鼠的不成熟中性粒细胞比例维持在较高水平，而G-CSF在增加成熟中性粒细胞方面比ZGSII更有效。然而，中性粒细胞成熟指数分析显示，ZGSII处理在Day 6时将该比率恢复到接近正常水平，而G-CSF则恢复到高于正常水平。这表明，虽然两种药物都能促进中性粒细胞生成，但G-CSF可能导致过度骨髓动员，而ZGSII支持了更平衡的重建，未过度消耗造血储备。
3.3 ZGSII通过恢复转录程序促进中性粒细胞成熟以逆转CIN
为进一步阐明ZGSII促进中性粒细胞分化和改善CIN的机制，研究人员在第4天和第6天对小鼠骨髓样本进行了RNA测序。比较分析发现了大量的差异表达基因。对骨髓微环境中免疫细胞浸润的分析表明，CY处理在第4天导致了骨髓中性粒细胞的显著耗竭，而ZGSII治疗逆转了这一现象。时序聚类分析进一步显示，ZGSII显著逆转了CY诱导的转录改变。基因本体论（GO）富集分析表明，这些基因在白细胞迁移、髓系白细胞活化、炎症反应调节等生物过程高度富集。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析则揭示了与白细胞跨内皮迁移、细胞因子-细胞因子受体相互作用、造血细胞谱系等通路显著相关。
3.4 ZGSII通过上调关键发育基因促进晚期中性粒细胞分化和活化
为描绘ZGSII调控的中性粒细胞发育阶段，研究人员分析了公共数据集GSE137539，重点关注正常小鼠样本的中性粒细胞相关群体。通过整合中性粒细胞亚群与先前定义的差异表达基因，研究人员确定了37个关键基因。这些基因在ZGSII处理后上调，并且在具有更高分化和成熟度评分的G3至G5亚群中富集。GO富集分析显示，这些关键基因在髓系白细胞迁移、白细胞趋化性、中性粒细胞活化等生物过程中显著富集。
3.5 ZGSII通过转录调节因子SPI1和C/EBP?促进粒细胞分化和成熟
为阐明ZGSII缓解CIN的分子机制，研究人员基于37个关键基因构建了蛋白质-蛋白质互作网络，发现了多个枢纽基因，如Ltf、Lcn2、Cxcr2、Mmp8/9和S100a8/9。RT-qPCR验证了包括Ltf、Cxcr2在内的部分基因mRNA表达水平，蛋白质印迹分析进一步证实了LTF和CXCR2的蛋白表达。结果显示，ZGSII处理在转录和翻译水平上逆转了LTF和CXCR2的失调。转录因子分析显示，SPI1和C/EBP?被确定为最核心的调控因子。这些结果表明，ZGSII很可能通过调节SPI1和C/EBP?的活性来促进中性粒细胞的发育和成熟。
3.6 计算模拟揭示ZGSII与SPI1和C/EBP?的结合模式和亲和力
为进一步阐明ZGSII的作用机制，研究人员进行了分子对接和分子动力学模拟。对接结果显示，ZGSII对SPI1和C/EBP?都具有高结合亲和力，结合自由能分别为-7.073 kcal/mol和-7.235 kcal/mol。分子动力学模拟评估了复合物的动力学行为。结果表明，C/EBP?-ZGSII复合物表现出构象可塑性和适应性结合特性，而SPI1-ZGSII复合物则显示出刚性结合模式。分子力学广义玻恩表面积法计算得到C/EBP?-ZGSII复合物和SPI1-ZGSII复合物的结合自由能分别为-29.94 ± 5.40 kcal/mol和-14.12 ± 1.16 kcal/mol，表明两者均存在强结合相互作用，且ZGSII对C/EBP?的亲和力更高。蛋白质水平验证显示，与对照组相比，CY模型组中SPI1和C/EBP?的表达显著降低，而ZGSII干预有效上调了这两种转录因子的蛋白表达水平。
3.7 ZGSII诱导NB4细胞分化并抑制其增殖
研究人员利用人早幼粒白血病NB4细胞系评估了ZGSII的作用。CCK-8检测显示，ZGSII以剂量和时间依赖性的方式抑制细胞生长。在诱导分化浓度下处理120小时后，流式细胞术分析未发现细胞周期分布或凋亡率发生显著改变。然而，流式细胞术和Wright-Giemsa染色均证实了ZGSII能诱导浓度依赖性的分化，并伴有特征性的形态学成熟。这表明ZGSII对NB4细胞的生长抑制与髓系分化特异性相关，而非普遍的细胞增殖抑制。
3.8 ZGSII有效增强中性粒细胞功能并赋予CIN小鼠生存优势
此外，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测了血清中细胞因子GM-CSF、IL-6和TNF-α的水平。结果显示，CY处理显著降低了血清GM-CSF水平，同时显著增加了促炎细胞因子IL-6和TNF-α的水平。这些改变均被G-CSF或ZGSII给药显著逆转。功能评估表明，ZGSII处理增强了中性粒细胞效应功能：与CY对照组相比，其吞噬能力接近正常水平，而活性氧（ROS）的生成则通过硝基蓝四氮唑（NBT）还原实验测量增加了1.8倍。这些功能的恢复与CIN小鼠在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）攻击下的生存率改善相关。在高剂量和低剂量细菌感染模型中，ZGSII处理均显著延长了小鼠的生存期，证实了所观察到的血液学恢复具有功能性意义。
4 讨论
本研究证明，ZGSII能有效对抗CIN，并通过转录调控关键的造血程序促进中性粒细胞重建，同时恢复中性粒细胞功能并提高菌血症宿主的生存率，从而维持骨髓稳态。ZGSII显著补充了外周中性粒细胞群，并减轻了环磷酰胺诱导的中性粒细胞减少症模型中的骨髓组织细胞减少。值得注意的是，ZGSII增强了中性粒细胞恢复，而未诱导过度骨髓动员，这意味着它平衡地恢复了造血功能，避免了与G-CSF治疗相关的快速祖细胞耗竭风险。RNA-seq分析表明，ZGSII给药与CY诱导的转录改变显著逆转相关，特别是在与白细胞迁移、髓系细胞活化和炎症反应调节相关的通路基因中。该研究鉴定了37个相关基因，并揭示了以Ltf、Cxcr2、Mmp8/9和S100a8/9等为核心的功能网络。机制观察表明，ZGSII通过调节关键转录调节因子介导中性粒细胞分化。计算对接和分子动力学模拟提示，ZGSII可能通过激活SPI1驱动造血干细胞向髓系分化，并通过诱导C/EBP?激活促进粒细胞成熟。经ZGSII处理的NB4细胞表现出与髓系分化特异性相关的生长抑制。ZGSII恢复了中性粒细胞的吞噬能力，并通过NBT还原实验增强了ROS的生成，这表明其功能恢复超越了单纯的数值恢复。这些细胞和分子的改善转化为CIN小鼠在感染金黄色葡萄球菌后的显著生存获益。与传统的G-CSF等生长因子疗法相比，ZGSII似乎具有独特的治疗优势，后者主要刺激细胞增殖。虽然G-CSF加速中性粒细胞增殖，但ZGSII通过转录调控增强了定向分化和功能成熟。此外，其细胞因子调节作用可能有助于减轻与化疗相关的炎症并发症。本研究也存在一些局限性，例如长期毒性、药代动力学/药效学研究以及与聚乙二醇化G-CSF的比较需要进一步研究；研究主要依赖于NB4细胞系，其可能无法完全概括正常造血祖细胞的生物学特性；未来需要使用遗传学或药理学方法抑制SPI1和C/EBP?来确立其因果关系。
5 结论
总之，本研究结果表明，ZGSII通过转录调控SPI1和C/EBP?，显著改善化疗诱导的中性粒细胞减少症，促进中性粒细胞重建。这些发现为ZGSII作为一种减轻化疗所致血液学毒性且不影响治疗效果的潜在治疗剂提供了临床前证据。
