《Frontiers in Plant Science》：Genome-wide identification of the EXO70 genes to elucidate their potential roles for intraspecific cross-incompatibility in sweet potato (Ipomoea batatas L.)
编辑推荐：
这篇研究首次在甘薯（Ipomoea batatas L.）中系统鉴定了EXO70基因家族，揭示其进化保守性与表达特异性，并锁定候选基因IbEXO70-26（属EXO70H亚组）在调控种内杂交不亲和性（ICI）中的关键作用，为深入解析甘薯花粉-柱头互作的分子机制提供了重要线索。
1 引言
甘薯（Ipomoea batatas L.）作为全球七大粮食作物之一，具有高产、适应性强和营养丰富等特点。然而，在育种过程中，种内杂交不亲和性（ICI）频繁发生，成为限制亲本组合和育种进展的主要瓶颈。甘薯已根据ICI划分为16个不亲和群（A至O及X），同一群内品种间杂交不亲和，不同群间则兼容。ICI的表现型为不亲和组合中花粉无法在柱头上萌发，这与孢子体自交不亲和（SSI）的表现型相似，其特征是柱头胼胝质积累。
在十字花科（Brassicaceae）中，SSI的调控机制已较为明确，涉及SCR（S位点半胱氨酸丰富蛋白）与SRK（S位点受体激酶）的识别，并通过下游ARC1（Arm重复包含蛋白1）介导EXO70的泛素化降解，从而破坏分泌囊泡运输，抑制花粉水合与花粉管萌发。EXO70作为外囊复合体的关键亚基，在囊泡运输和胞吐作用中扮演核心角色，在真核生物中高度保守。在陆地植物中，EXO70基因家族经历了显著扩张，分为三个主要分支（EXO70.1、EXO70.2、EXO70.3）和九个亚组（EXO70A-I），参与多种生长发育过程。例如，在拟南芥中，EXO70A1是SSI系统中的关键兼容性决定因子；EXO70A2的破坏会降低花粉萌发效率；EXO70C2则是花粉管顶端生长的主要调节因子。
然而，在甘薯中，对EXO70基因的研究仍很有限。前期转录组分析发现，多个EXO70基因在杂交亲和与不亲和样本中存在差异表达，提示该家族成员可能参与甘薯种内杂交不亲和性的调控。因此，本研究旨在：（1）全面鉴定甘薯基因组中的EXO70家族基因；（2）系统分析其结构特征与表达模式，以筛选参与ICI调控的候选基因。
2 材料与方法
本研究使用了三个甘薯品种：‘广薯79’（GS79）、‘广薯146’（GS149）和‘商薯19’（SS19）。其中，GS146（母本）与GS79（父本）构成杂交亲和组合，GS146（母本）与SS19（父本）构成杂交不亲和组合。
利用HMMER软件和EXO70的隐马尔可夫模型（PF03081）从甘薯‘台中6号’基因组中鉴定候选EXO70基因，并通过CDD数据库确认保守结构域，最终获得IbEXO70家族成员。同时，从二倍体近缘种Ipomoea trifida和Ipomoea triloba基因组中鉴定同源基因。利用MEGA软件进行多序列比对并构建系统发育树（邻接法，Poisson校正模型，1000次自举重复）。
通过ExPASy ProtParam分析蛋白质理化性质；使用WoLF PSORT预测亚细胞定位；利用TBtools进行染色体分布、基因结构（外显子-内含子）可视化及保守基序分析；使用PlantCARE对启动子区（转录起始位点上游2000 bp）的顺式作用元件进行预测。
采用MCScanX分析基因复制事件（串联复制和片段复制），并利用TBtools进行共线性分析。
通过qRT-PCR（实时定量PCR）分析35个IbEXO70基因在16种不同组织（包括花瓣、花蕾期、芽期、花托、柱头、花粉、亲和授粉柱头、不亲和授粉柱头、功能叶、新展叶、叶柄和茎等）中的表达谱。
将IbEXO70-26的全长编码序列克隆至pCAMBIA1300-GFP载体，通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的瞬时转化在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中表达，利用激光共聚焦显微镜观察GFP融合蛋白的亚细胞定位。
3 结果
3.1 EXO70基因家族在Ipomoea物种中的鉴定、染色体定位与特征
在三个Ipomoea物种中共鉴定到94个EXO70基因：六倍体甘薯（I. batatas）35个，二倍体近缘种I. trifida 30个和I. triloba 29个。这表明EXO70基因家族在Ipomoea中高度保守，多倍化后未发生大规模基因扩张。
染色体分布分析显示，基因分布不均匀。在二倍体物种I. trifida和I. triloba中，EXO70基因主要集中在2、4、5和7号染色体上，分布模式高度相似。而在六倍体甘薯中，IbEXO70基因分布在除3号染色体外的所有15条染色体上，主要集中在1、2、12、13和14号染色体上，这暗示了多倍体进化过程中可能存在染色体重排或功能特化。
根据染色体位置，基因被命名为IbEXO70-1至35、ItfEXO70-1至30和ItbEXO70-1至29。理化性质分析显示，IbEXO70蛋白长度在406（IbEXO70-1）至1163（IbEXO70-17）个氨基酸之间，分子量45.32至128.65 kDa，等电点（pI）4.74至9.16。亚细胞定位预测表明，大多数IbEXO70蛋白定位于叶绿体和细胞质，仅IbEXO70-14和IbEXO70-32预测定位于细胞核。
3.2 不同物种EXO70基因的系统发育分析
利用I. batatas、I. trifida、I. triloba、拟南芥（A. thaliana）和水稻（O. sativa）的EXO70蛋白序列构建系统发育树。所有基因被分为三个主要分支：EXO70.1、EXO70.2和EXO70.3，并可进一步划分为九个亚组（EXO70A-I）。其中，EXO70.1分支仅包含EXO70A亚组（29个基因，占18.35%）；EXO70.2分支包含六个亚组（EXO70B-F和H，97个基因，占61.40%）；EXO70.3分支包含EXO70G和I两个亚组（32个基因，占20.25%）。
EXO70H亚组基因数量最多，表明其在双子叶植物中经历了快速扩张，其次是EXO70A，而EXO70F成员最少。亚组分布在Ipomoea物种间高度保守，特别是在EXO70B-F亚组中，基因数量几乎相同。相比之下，单子叶植物水稻在EXO70I亚组中含有更多基因，且该亚组在双子叶植物中缺失，这揭示了EXO70基因在单双子叶植物间的差异。
3.3 Ipomoea物种EXO70基因的结构分析
基于进化关系，对EXO70家族成员的保守蛋白基序和基因结构进行了系统分析。共鉴定出10个保守基序，广泛分布于三个物种的EXO70蛋白中。所有成员均包含保守的EXO70结构域。
外显子/内含子组织分析揭示了显著的结构多样性。外显子和内含子数量相对较高的基因主要聚集在EXO70A亚组。例如，IbEXO70-15包含13个外显子，ItfEXO70-14和ItbEXO70-15各包含12个外显子。相比之下，其他亚组的EXO70基因通常只包含1到3个外显子。同一亚组内的基因也表现出明显的结构变异，例如在EXO70H亚组中，IbEXO70-17包含8个外显子，而ItfEXO70-10和ItbEXO70-11仅包含1个外显子。这表明同一亚组内的EXO70基因在结构上存在相当大分歧，可能反映了功能分化或谱系特异性进化适应。
3.4 I. batatas EXO70基因的顺式作用元件分析
对35个IbEXO70基因转录起始位点上游2 kb的启动子区进行了顺式作用元件分析。共鉴定出30种顺式调控元件，可分为五大类：激素响应元件、光响应元件、植物生长发育相关元件、非生物与生物胁迫响应元件以及转录因子结合位点。
激素响应元件是最丰富的类别，包括九种类型：ABRE（脱落酸响应）、AuxRR-core（生长素响应）、TGA-element、CGTCA-motif、TGACG-motif（茉莉酸甲酯响应）、GARE-motif、P-box、TATC-box（赤霉素响应）和TCA-element（水杨酸响应）。除IbEXO70-6外，所有IbEXO70基因的启动子区都至少含有一个植物激素响应元件。其中，参与脱落酸信号转导的ABRE元件最为普遍，提示IbEXO70基因可能在脱落酸介导的调控通路中发挥作用。
此外，还检测到多个光响应元件（如ACE、G-box、GT1-motif等），表明IbEXO70基因可能参与光调控的生物学过程。启动子区还含有与胁迫响应相关的元件（如ARE、LTR、TC-rich repeats等），以及转录因子结合位点（如MBS、MBSI等）。这些结果表明，IbEXO70基因可能受到多种环境和发育信号的调控，并参与广泛的生物过程。
3.5 I. batatas中EXO70基因的共线性分析
共线性分析发现了串联复制和片段复制事件。检测到两个串联复制对：IbEXO70-19/IbEXO70-20和IbEXO70-32/IbEXO70-33。同时鉴定出八个片段复制对，例如IbEXO70-31/IbEXO70-18、IbEXO70-13/IbEXO70-16等。这些结果表明，片段复制是驱动甘薯EXO70基因家族进化的主要机制，而串联复制的作用相对较小。
多物种比较共线性分析显示，Ipomoea属内基因组保守性很高。在I. batatas与I. trifida之间鉴定出46个直系同源EXO70基因对，与I. triloba之间鉴定出40对。相比之下，与较远缘物种的同源基因对数量减少：与双子叶植物拟南芥有22对，与单子叶植物水稻仅有8对。这表明甘薯EXO70基因家族与双子叶物种具有更高的进化保守性。分析表明，甘薯EXO70基因的扩张和多样化可能发生在与单子叶植物分化之后、但在Ipomoea属内物种形成之前。
3.6 IbEXO70家族基因的组织特异性表达动态
通过qRT-PCR检测了35个IbEXO70家族成员在甘薯不同组织中的表达模式。总体上，大多数基因在花蕾期、芽期、开花植株叶柄、非开花植株茎和叶柄中表达水平较低。相比之下，在其余被检组织中，至少有一个IbEXO70基因表达上调。值得注意的是，在花粉中检测到7个基因表达峰值，在亲和授粉柱头（GS 146 × GS 79）中检测到8个，在不亲和授粉柱头（GS 146 × SS 19）中检测到9个。这些组织特异性和授粉特异性表达模式表明，IbEXO70基因积极参与生殖过程，特别是在花粉功能和授粉期间的柱头响应中，并可能在调控甘薯花粉-柱头互作中发挥重要作用。
为深入探究IbEXO70基因在甘薯ICI调控中的作用，我们聚焦于在亲和授粉柱头中相较于不亲和或未授粉柱头显著上调表达的基因。根据qRT-PCR结果，鉴定出八个候选基因：IbEXO70-7、IbEXO70-13、IbEXO70-24、IbEXO70-26、IbEXO70-27、IbEXO70-28、IbEXO70-30和IbEXO70-34。其中，IbEXO70-13、IbEXO70-30和IbEXO70-34在所有16种组织中普遍表达，暗示其具有更广泛的细胞功能。相比之下，IbEXO70-26和IbEXO70-27表达水平最高，并表现出显著的组织特异性，主要在授粉后柱头、未授粉柱头、花粉和花托组织中优势表达，而在其他组织中表达极低。这种独特的表达模式表明，IbEXO70-26和IbEXO70-27可能在生殖发育和花粉-柱头互作中扮演特化角色，是参与甘薯ICI的强候选基因。
前期转录组分析曾鉴定出六个在ICI中差异表达的IbEXO70基因：IbEXO70-4、IbEXO70-12、IbEXO70-15、IbEXO70-16、IbEXO70-17和IbEXO70-26。其中，IbEXO70-26是唯一一个在MFT（亲和授粉柱头）与FT（不亲和授粉柱头）比较组中显示出显著表达差异的基因，而在FT vs CK（未授粉柱头）和MT（经杂交不亲和克服试剂处理的柱头）vs CK中未检测到显著差异。这种独特的表达模式进一步支持IbEXO70-26是调控甘薯种内杂交不亲和性的关键候选基因。
3.7 IbEXO70-26的亚细胞定位
为了探究IbEXO70-26的潜在功能，将其全长编码序列与绿色荧光蛋白（GFP）融合，进行亚细胞定位分析。自由GFP对照的荧光信号出现在细胞质、细胞膜和细胞核中。相比之下，IbEXO70-26-GFP融合蛋白的荧光信号仅存在于细胞核中，这表明IbEXO70-26主要定位于细胞核。这一发现与大多数EXO70家族成员定位于细胞质和细胞膜的经典模式不同，但与EXO70H在烟草和拟南芥中定位于细胞核的报道一致。
4 讨论与结论
本研究基于基因数量、染色体分布、结构特征和分类，探究了甘薯EXO70基因家族的进化关系。在三个Ipomoea物种中鉴定到94个EXO70基因，六倍体甘薯与二倍体近缘种之间基因数量相近，表明EXO70家族基因在Ipomoea物种间高度保守。这与棉花和小麦中EXO70基因数量随基因组多倍化而增加的情况不同，可能归因于六倍体甘薯六套基因组间的高同源性以及多倍化过程中未发生基因复制。然而，EXO70基因的染色体分布存在明显差异，这可能是多倍体进化过程中染色体重排、片段复制和基因易位的结果，并可能导致不同的生物学功能。这些发现支持甘薯是自体六倍体或异源六倍体物种的假说。
系统发育分析将Ipomoea物种的EXO70基因分为三个主要分支和九个亚组，与其他植物的研究一致。EXO70A-H亚组的基因分布和结构构建在栽培甘薯与其野生近缘种之间高度相似，进一步证明了EXO70基因在Ipomoea中的保守性。与拟南芥、棉花、黄瓜等相比，Ipomoea物种中的EXO70A亚组有效扩增，尤其是IbEXO70A亚组拥有10个基因。与其它植物物种类似，EXO70A亚组成员持续含有更多的外显子。共线性分析揭示，串联复制和片段复制共同促进了IbEXO70基因家族的进化，其中片段复制是主要机制。值得注意的是，片段复制对中有三对来自IbEXO70A亚组。由于EXO70A参与典型的外囊功能，在极性胞吐、极性生长和细胞壁生物合成中至关重要，这暗示IbEXO70A基因可能在甘薯发育和生长中扮演重要角色。
启动子分析为IbEXO70基因的调控潜力提供了见解。鉴定出大量与植物激素信号相关的顺式作用元件，特别是与ABA信号和非生物胁迫响应相关的ABRE元件。此外，也识别出光响应和胁迫响应元件。这些发现表明，IbEXO70基因受到多种环境和发育信号的调控，可能参与包括胁迫适应和生殖发育在内的多个生物过程。
跨组织表达谱分析显示，数个IbEXO70基因在生殖器官，特别是花粉和柱头中优先表达。重要的是，九个IbEXO70基因在亲和与不亲和授粉柱头之间表现出显著的差异表达。其中，IbEXO70-26在亲和柱头中表现出特异且高水平的表达，而在其他组织中表达水平低。转录组差异分析进一步证实，IbEXO70-26是唯一在MFT和FT比较组中显示显著表达差异的EXO70基因。这种独特的表达模式强烈提示IbEXO70-26在调控甘薯种内杂交不亲和性中具有特异性作用。
在十字花科中，EXO70A1已被确定为兼容性因子，其功能丧失突变会破坏花粉水合并抑制花粉管伸长。然而，IbEXO70-26属于EXO70H亚组，并在亲和柱头中相较于属于EXO70A亚组的IbEXO70-7和IbEXO70-34表现出显著的表达差异。拟南芥中EXO70H的功能研究表明，EXO70H1参与病原体响应；EXO70H3、EXO70H5、EXO70H6在花粉中高表达；而EXO70H4在胼胝质合酶分泌中具有特异性作用。柱头乳突细胞中胼胝质沉积已被证明是抑制花粉萌发和触发甘薯ICI的关键因素。此外，IbEXO70-26基因含有MYB转录因子结合位点，而MYB转录因子对于正常花粉萌发和结实至关重要。这些观察共同表明，作为EXO70H亚组成员，IbEXO70-26可能通过调节花粉-柱头识别信号并影响亲和授粉期间的花粉管生长，作为一种替代的兼容性响应因子发挥作用。
先前研究大多表明EXO70蛋白主要定位于细胞质和细胞膜，在胞吐作用、囊泡运输和极性生长中发挥作用，这些过程与自交不亲和反应中的花粉水合和花粉管发育密切相关。然而在本研究中，IbEXO70-26特异定位于细胞核，这与大多数EXO70家族成员的经典定位模式显著不同。这与EXO70H在烟草和拟南芥中定位于细胞核的报道一致。推测IbEXO70-26基因在调控甘薯ICI中发挥非典型的分泌功能，而是在信号转导和转录调控中发挥作用，从而影响下游兼容或不兼容基因的表达。
综上所述，本研究全面分析了甘薯EXO70基因家族的进化特征、结构特点、表达模式及潜在功能。我们的结果将IbEXO70-26鉴定为参与调控甘薯种内杂交不亲和性的强候选基因。尽管需要进一步的功能验证，但本工作为未来研究，包括IbEXO70-26的遗传转化和分子解析，以阐明其在甘薯生殖兼容性中的确切作用奠定了坚实的基础。
