3′非翻译区（3′UTR）测序揭示了右心室衰竭中的替代性多聚腺苷酸化现象

《Circulation Research》：3′UTR Mapping Reveals Alternative Polyadenylation in Right Ventricular Failure

右心室衰竭中替代多聚腺苷酸化（APA）机制通过CPSF6调控纤维化。研究发现RVF患者右心室组织存在主导的3'UTR短ening APA重塑，涉及TGF-β信号通路及氧化磷酸化，而左心室无显著重叠。CPSF6在RVF中特异性下调，其基因沉默导致纤维化相关基因UTR短ening和胶原沉积增加，过表达则逆转此过程。提示APA重塑尤其是CPSF6调控可能成为RVF治疗靶点。

　　

右心室（RV）衰竭（RVF）是肺动脉高压导致死亡的主要因素，¹但其分子机制尚不清楚。尽管RV对压力负荷的适应涉及不同的基因表达和结构重塑，但驱动这一过程的转录后机制仍不明确。

人类组织与测序

RV组织来自4名世界卫生组织I组肺动脉高压患者（平均年龄45岁，均为女性），这些患者接受了心肺移植手术，以及4颗供体心脏。所有患者的RV功能障碍均较严重，肺动脉收缩压在70至140毫米汞柱之间。从快速冷冻的RV组织中生成了Poly A-Click（PAC）-seq文库，并使用PolyA-miner进行分析。²所有人类组织的收集和实验程序均按照休斯顿卫理公会医院机构审查委员会批准的方案进行。由于样本量有限，对研究结果需谨慎解读。

衰竭人类RV的APA景观

全球PAC-seq分析显示3′UTR发生了广泛的重塑，以缩短为主（509个缩短的转录本对比140个延长的转录本；图[A]和B）。Poly(A)指数表示近端PAS使用量与远端PAS使用量的对数2比值；负值表示缩短，正值表示延长。缩短的转录本富集了与TGF-β信号通路、肌生成和氧化磷酸化相关的基因，包括、TPM3、SELENOS和TRIB2，这些基因与ECM沉积和成纤维细胞激活有关。与延长的3′UTR相关的通路较少，这突显了RVF中缩短现象的主导地位。与左心室的APA图谱（Creemers等人³）相比，重叠部分极小（<4%），证实了RV特有的APA重塑。图[C]

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图。替代性多聚腺苷酸化重塑通过CPSF6依赖的3′UTR调控驱动右心室（RV）衰竭的进展：A和B。 该图展示了用于识别多聚腺苷酸化位点并量化APA的替代性APA分析工作流程。对人类RV组织的Poly(A)-ClickSeq（PAC-seq）分析显示，在终末期RV衰竭中存在广泛的APA重塑，以3′UTR缩短为主（509个缩短的转录本，140个延长的转录本）。缩短转录本的通路富集分析结果如图所示。C，与已发表的左心室（LV）APA数据集（Creemers等人）相比，RV缩短、RV延长、LV缩短和LV延长的基因集之间的重叠部分极小（<4%），支持腔室特异性的RNA 3′末端重塑。D和E，将转录组数据（GSE198618）整合到对照组、代偿期和失代偿期RV的数据中，发现仅在失代偿期出现APA激活——57个缩短的转录本上调，147个下调；代偿期和失代偿期也有类似趋势。富集的通路包括TGF-β、EMT、炎症反应、p53和补体信号通路。F至I，通过CPSF6（一个核心的远端PAS调节因子）显示，PAC-seq（基因组浏览器视图）、定量聚合酶链反应（qPCR；远端PAS使用量）和Western blot显示，在衰竭的RV中3′UTR延长和下调。配对的LV–RV样本和外部验证（GSE198618）证实了失代偿期RV中CPSF6的特异性抑制。J至P，在人类心脏成纤维细胞中敲低CPSF6可诱导3′UTR缩短，激活TGF-β/ECM通路，增加COL1A1蛋白表达，并增强收缩力。Q，在原发性右心室衰竭（RVF）成纤维细胞中过表达CPSF6可恢复远端PAS使用量，延长纤维化基因的3′UTR，并减少COL1A1表达。数据为平均值±标准误差。统计测试包括Beta-Binomial检验（B和K）、非配对双尾检验（J和P）、Mann-Whitney U检验（F、G、O和Q）、单样本Wilcoxon检验与0的比较（N和Q）、Wilcoxon配对符号秩检验（HI）。

APA重塑与RV衰竭向失代偿期的转变具体相关

为了确定APA激活是早期适应还是失代偿的标志，我们将PAC-seq数据与GSE198618队列（对照组、代偿期RVH、失代偿期RVF）进行了整合。对照组和代偿期心脏之间没有APA–DEG重叠，但在失代偿期RV中出现了显著的重叠（57个缩短的基因上调；147个缩短的基因下调；图[D]和E）。通路分析突出了TGF-β信号通路、IL-6/JAK/STAT3、EMT和炎症反应。这些发现表明APA重塑是与纤维化和炎症相关的失代偿特异性过程。

CPSF6在衰竭的人类RV中选择性下调并与3′UTR延长相关

从RV PAC-seq数据集中获得的Poly(A)位点映射显示，在CPSF6转录本中，远端PAS的使用量有明显增加，这在UCSC浏览器中表现为从近端到远端的PAS峰值清晰转变（图[F]）。这种3′UTR延长通过dPAS使用量测定得到验证，证实了衰竭RV中远端位点的利用增加。在蛋白质水平上，Western blot分析显示衰竭RV中的CPSF6显著减少（图[G]，底部面板）。重要的是，来自同一患者的配对左心室和RV样本显示CPSF6的损失仅限于RV，而左心室的表达保持不变（图[H]，底部面板）。这种腔室间的比较强调了CPSF6下调在RVF中的特异性。

对外部数据集GSE198618的分析进一步支持了这些发现。CPSF6在对照组和代偿期RV中的表达没有变化，但在对照组与失代偿期RV以及代偿期RV之间的比较中显著下降（图[I]）。这种随着疾病进展的逐步减少证实了我们的观察结果，并确定CPSF6下调是RV失代偿的显著分子特征。

CPSF6的损失足以诱导全局3′UTR缩短并激活纤维化通路

为了验证因果关系，在原代人类心脏成纤维细胞中沉默了CPSF6。PAC-seq显示广泛的3′UTR缩短，影响了超过2000个转录本（图[J]和K）。促纤维化基因（包括< />和COL1A1）显示出显著缩短，这一结果通过PAC-seq和定量聚合酶链反应得到证实，UCSC浏览器分析显示PAS使用量向近端转移。通路富集分析显示TGF-β信号通路的参与。缩短的3′UTR与COL1A1表达增加和超过60%的胶原凝胶收缩相关，而对照组仅为约25%（图[L]至[P]）。CPSF6的损失驱动APA重塑，通过TGF-β激活促进成纤维细胞转变和纤维化。

CPSF6过表达可逆转衰竭RV成纤维细胞中的纤维化3′UTR重塑

来自衰竭人类RV组织的原代成纤维细胞表现出高胶原沉积和促纤维化标志物表达（图[Q]）。腺病毒CPSF6输送（Ad-CMV-CPSF6-GFP）延长了纤维化转录本的3′UTR，并减少了胶原I蛋白表达，与对照组（Ad-CMV-GFP）相比（图），表明CPSF6的恢复可逆转病理性的APA重塑。Masson三色染色证实了胶原丰富的重塑，强调了CPSF6依赖的纤维化调控。

结论

APA重塑是人类RVF的显著特征，涉及效应基因的变化和核心多聚腺苷酸化机制的破坏。尽管样本量有限，但多层次验证证实了其生物学相关性。我们从接受心肺联合移植的罕见终末期肺动脉高压患者中获得的RVF样本强调了这些发现的转化意义。针对APA或恢复CPSF6可能具有治疗潜力，为机制研究和临床研究提供了框架。