《Plant Biotechnology Journal》：AhBWR15, A Novel RLK Gene, Confers Resistance to Ralstonia solanacearum in Peanut
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本研究报道了在花生中克隆到一个新的青枯病（BW）抗性数量性状位点（QTL）qBWR15，并鉴定出其关键候选基因AhBWR15。该基因编码一个富含亮氨酸重复序列的类受体激酶（LRR-RLK），其特有的非同义突变（G > A）仅存在于高抗品种农大花108中。功能验证表明，AhBWR15定位于质膜，其过表达能通过激活脱落酸（ABA）信号通路，增强花生对青枯菌（Ralstonia solanacearum）的抗性。研究为花生抗青枯病育种提供了新的靶基因和分子标记（KASP），并揭示了一种由LRR-RLK介导、依赖于ABA信号的新型抗病通路。
1 引言
花生（Arachis hypogaeaL.）是全球重要的油料和粮食作物，但其生产受到由青枯菌（Ralstonia solanacearum）引起的青枯病（BW）的严重威胁，可导致50%-100%的产量损失。培育具有持久抗性的品种是最高效环保的防治策略。农大花108（H108）是一个兼具高产和高抗青枯病特性的花生新品种，解析其抗性机制具有重要价值。植物对青枯病的抗性通常由数量性状控制，目前已鉴定出数个抗性QTL，但尚未有抗性基因被克隆和功能验证。除了典型的NBS-LRR类抗性（R）基因，富含亮氨酸重复序列的类受体激酶（LRR-RLK）也被报道参与植物抗病。本研究旨在系统解析H108对青枯病的抗性遗传基础，鉴定关键抗性基因并阐明其作用机制。
2 结果
2.1 H108品种青枯病抗性的BSA-seq分析
研究利用高感品种农大花107（H107）与高抗品种H108杂交，构建了包含432个个体的F2分离群体。通过接种青枯菌进行表型鉴定后，选取极端抗病和极端感病的各30个单株分别构建抗、感池（RB和SB），并结合亲本进行批量分离分析测序（BSA-seq）。通过对SNP-index和Δ(SNP-index)的滑动窗口分析，在15号染色体（B05）上定位到一个与抗性显著相关的5.9 Mb候选区间，该主效QTL被命名为qBWR15。
2.2 新位点qBWR15的精细定位
为了精细定位qBWR15，研究在候选区间内开发了25个新分子标记，并利用H108×H107衍生的151个重组自交系（RIL）群体进行基因型分析。最终将qBWR15精细定位到标记ZH_SSR2和ZH_InDel9之间一个668 kb的基因组区域内。该区间包含32个候选基因，其中4个基因存在非同义突变。组织特异性表达分析显示，只有一个编码LRR-RLK的基因（AH15G25210）在各组织中高表达，且在H108中受青枯菌侵染后显著上调。因此，该LRR-RLK基因被确定为qBWR15的关键候选基因，命名为AhBWR15。
2.3 AhBWR15的单倍型与系统发育分析
CDS序列比对发现，AhBWR15在H107和H108之间存在一个非同义SNP突变：在CDS第1216 bp处存在一个G > A的替换。该突变导致编码蛋白第618位氨基酸由甘氨酸（G）变为天冬氨酸（D）。对238份花生自然种质的分析表明，该新颖突变仅存在于H108及其衍生品种中。基于该SNP（命名为ZH_SNP1）在RILs中的单倍型分析表明，76%的感病RILs携带感病单倍型（Hap-S），而64%的抗病RILs携带抗病单倍型（Hap-R）。蛋白质结构预测显示，AhBWR15蛋白包含信号肽、三个LRR结构域、一个跨膜（TM）结构域和一个丝氨酸/苏氨酸激酶（STK）结构域，该SNP突变位于TM和STK结构域之间，并导致蛋白质三维构象发生显著变化。系统发育分析表明，AhBWR15与已克隆的水稻白叶枯病抗性蛋白Xa21和Xa26亲缘关系较近。
2.4 AhBWR15的表达谱与亚细胞定位
对AhBWR15启动子序列的分析发现了多个与植物激素应答及生物/非生物胁迫相关的顺式作用元件。qRT-PCR表达谱分析显示，AhBWR15在青枯菌侵染后表达上调，且在H108中的上调幅度显著高于H107。外源水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和脱落酸（ABA）处理均能诱导AhBWR15的表达。亚细胞定位实验显示，AhBWR15-YFP融合蛋白与质膜标记蛋白PIP2a-RFP在烟草叶片和原生质体中均共定位于质膜，表明AhBWR15是一个质膜定位的LRR-RLK蛋白。
2.5 过表达AhBWR15增强花生和烟草对青枯菌的抗性
在花生叶片中瞬时过表达AhBWR15-YFP并接种青枯菌后，与表达YFP的对照相比，过表达植株的细胞死亡和病斑面积显著减少，同时防御相关基因AhDef2.2、AhPYL6和AhHRS203的表达显著上调。在烟草叶片中的瞬时过表达实验得到了类似结果：过表达AhBWR15能显著减轻青枯菌引起的叶片损伤和坏死斑，减少细胞死亡和活性氧（ROS）积累，并上调NbHRS203、NbNPR1、NbEFE26和NbNDR1等防御基因的表达。
为了进一步验证，研究通过发根农杆菌介导的毛根转化获得了过表达AhBWR15的花生植株。接种青枯菌28天后，过表达植株（OE-AhBWR15）的病情指数显著低于野生型（WT），且大部分过表达植株存活，而所有野生型植株均萎蔫死亡。此外，过表达植株根系中的青枯菌数量仅为野生型的四分之一。这些结果共同证明，过表达AhBWR15能显著增强花生对青枯菌的抗性。
2.6 AhBWR15通过激活ABA依赖的防御反应赋予青枯病抗性
为了阐明AhBWR15介导抗性的分子机制，研究对过表达和野生型植株的根组织进行了转录组测序分析。差异表达基因（DEGs）的GO和KEGG富集分析表明，植物-病原互作、植物激素信号转导、光合作用和苯丙烷生物合成等通路在抗性中起关键作用。特别值得注意的是，ABA信号通路、防御反应和光合作用相关基因在OE-AhBWR15植株中显著上调。内源ABA含量测定发现，青枯菌侵染后OE-AhBWR15植株根中的ABA水平升高。在H108植株上施用ABA生物合成抑制剂钨酸钠会削弱其抗性，这表明AhBWR15通过激活ABA依赖的防御反应来赋予抗性。
转录组数据还显示，AhBWR15过表达植株在病原侵染下，光合作用相关基因表达上调，其光系统II最大光化学效率（Fv/Fm）和叶绿素含量（SPAD值）也维持在较高水平。苯丙烷代谢通路相关基因（如PAL、CHI、CCR、POD）的诱导表达，暗示细胞壁木质素的合成增强。组织化学染色（PG和FY染色）证实，OE-AhBWR15植株的根细胞壁积累了更多的木质素，细胞结构受损更轻。综上所述，AhBWR15主要通过激活ABA介导的防御信号、维持光合作用效率以及促进木质素生物合成来赋予花生青枯病抗性。
3 讨论
本研究成功从高抗高产花生品种H108中克隆并鉴定了一个新的青枯病抗性基因AhBWR15。该基因编码一个LRR-RLK蛋白，其特有的SNP突变被开发成可用于分子标记辅助选择（MAS）育种的KASP标记。功能研究表明，AhBWR15通过整合SA、JA和ABA信号，激活下游防御反应，同时维持病原胁迫下的光合作用并增强细胞壁木质化，从而协同提高抗性。这项工作不仅为花生抗青枯病育种提供了宝贵的基因资源和分子工具，也揭示了一条由LRR-RLK介导的、依赖于ABA信号的新型抗病通路，对未来作物抗病育种具有重要的借鉴意义。
4 材料与方法
研究使用高抗品种H108和高感品种H107杂交构建F2和RIL群体用于遗传作图。采用剪叶法接种青枯菌进行抗性表型鉴定。利用BSA-seq结合亲本重测序进行QTL初定位，并开发分子标记进行精细定位。通过序列比对、单倍型分析、系统发育树构建、qRT-PCR、亚细胞定位、瞬时过表达、毛根转化、转录组测序、生理生化测定（ABA含量、光合参数、组织染色）等一系列实验，对候选基因AhBWR15进行了全面的功能验证和机制解析。所有数据均进行三次生物学重复，并使用SPSS进行统计学分析。
