AaaSIZ1介导的AaMYB31 SUMO化正向调控软枣猕猴桃的耐冻性

《Plant Biotechnology Journal》：AaSIZ1-Mediated SUMOylation of AaMYB31 Positively Regulates Freezing Tolerance in Actinidia arguta

本研究揭示了软枣猕猴桃（Actinidia arguta）响应低温胁迫的分子新机制，即AaSIZ1-AaMYB31s-AaKCSs模块通过促进表皮蜡质合成来增强耐冻性。研究发现低温胁迫能显著诱导蜡质合成基因AaKCS2/6.1等表达上调及蜡质积累。R2R3-MYB转录因子AaMYB31.1和AaMYB31.2被低温激活，并直接结合AaKCS基因启动子激活其表达，促进蜡质合成与耐冻性。进一步研究发现，SUMO E3连接酶AaSIZ1与AaMYB31s互作，介导其K76位点的SUMO化修饰，从而增强AaMYB31s蛋白稳定性，且该互作及SUMO化过程在低温下显著增强。过表达AaMYB31s或AaSIZ1均能提升猕猴桃蜡质含量与耐冻性。该工作首次阐明了SUMO化修饰调控蜡质合成以响应低温胁迫的分子通路，为利用分子育种培育抗寒猕猴桃新品种提供了关键靶点和理论依据。

　　

引言

猕猴桃富含维生素C，全球消费需求不断增长，但低温仍是制约其生产和地理分布的主要非生物胁迫因素。在猕猴桃属中，软枣猕猴桃（Actinidia arguta）表现出显著的耐寒性，其枝条可耐受低至-30°C的低温，是研究植物冷适应分子机制的宝贵遗传资源。虽然已有少数研究探索了软枣猕猴桃的耐寒调控机制，但蜡质合成在冷胁迫下的分子调控机制仍不清楚。研究表明，表皮蜡质积累能增强植物对冷胁迫的耐受性。蜡质主要由超长链脂肪酸（VLCFAs）及其衍生物组成，在植物表面形成保护屏障。同时，MYB转录因子和SUMO化修饰也被发现在蜡质合成和冷胁迫响应中扮演重要角色。本研究旨在揭示软枣猕猴桃中一个由SUMO E3连接酶、MYB转录因子和蜡质合成基因构成的调控模块如何协同作用以应对冷冻胁迫。

2 结果

2.1 低温胁迫诱导软枣猕猴桃蜡质合成

对低温处理的软枣猕猴桃进行转录组分析发现，有21个单倍型中的蜡质合成相关差异表达基因，其中16个基因受低温诱导上调。qPCR验证表明，AaKCS1和AaKCS11.1/11.2/11.3/11.4在3小时迅速增加并达到峰值，而AaKCS6.1/6.2、AaKAS1.1/1.3、AaKCS4.2、AaKCS19和AaKCS2在12小时达到峰值。扫描电镜（SEM）观察发现，随着冷胁迫时间延长，叶片表面表皮蜡晶数量显著增加，形状从颗粒状逐渐变为片状。气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）证实叶片总蜡质在48小时内迅速增加。其中，AaKCS6.1和AaKCS2的上调最为显著。在中华猕猴桃（Actinidia chinensis）中过表达AaKCS2或AaKCS6.1，无论是在正常还是冷胁迫条件下，转基因植株叶片的总蜡质含量和表皮蜡晶沉积均显著高于野生型。冷冻表型分析显示，过表达植株表现出更强的耐冻性，其离子渗漏率、丙二醛（MDA）含量、过氧化氢（H₂O₂）含量和超氧阴离子（O₂^·?）含量均显著低于野生型，而叶绿素含量则更高。这些结果表明，低温诱导的蜡质生物合成增强了猕猴桃的耐冻性。

2.2 AaMYB31s直接激活AaKCSs的表达

从单倍型中鉴定出27个受低温上调的MYB转录因子基因，其中16个先上调后下调。系统发育树分析显示，有4个MYB转录因子（AaMYB31.1, AaMYB31.2, AaMYB31.3, AaMYB31.4）与拟南芥的AtMYB31亲缘关系密切。其中AaMYB31.1和AaMYB31.2在冷胁迫下的表达水平显著高于AaMYB31.3和AaMYB31.4。亚细胞定位显示AaMYB31.1和AaMYB31.2定位于细胞核，组织特异性表达表明它们在叶片中表达最高。双荧光素酶报告基因（DLR）检测、酵母单杂交（Y1H）和电泳迁移率变动分析（EMSA）均证实，AaMYB31.1和AaMYB31.2能直接结合到AaKCS2和AaKCS6.1基因的启动子特定区域（如ProAaKCS2-P3、ProAaKCS6.1-P5），并激活其表达。

2.3 AaMYB31s通过正向调控蜡质合成增强耐冻性

在中华猕猴桃中过表达AaMYB31.1或AaMYB31.2，发现转基因植株叶片的总蜡质含量在正常和冷胁迫条件下均高于野生型。蜡质成分分析表明，总蜡质含量的增加主要归因于C24、C26、C28和C30脂肪酸，C28、C30和C32醛，C26、C28、C30和C32伯醇以及C29、C31和C33烷烃的增加。SEM观察也证实转基因植株叶片表面蜡晶沉积更多。此外，转基因植株中下游蜡质合成基因AcKCS1.1、AcKCS6.1、AcKCS12.1和AcKCS19.1的表达均显著上调。冷冻表型分析表明，过表达植株的耐冻性增强，体现在更低的离子渗漏率、MDA含量、H₂O₂和O₂^·?含量，以及更高的叶绿素含量。这些结果证明AaMYB31s通过促进蜡质合成来增强耐冻性。

2.4 AaMYB31s与AaSIZ1互作

利用AaMYB31.1作为诱饵进行Pull-down结合质谱（Pull-down MS）筛选，鉴定到一个可能的互作候选蛋白——SUMO E3连接酶AaSIZ1。该蛋白含有SAP结构域、PHD指和SP-RING结构域。酵母双杂交（Y2H）实验（使用去除自激活活性的AaSIZ1-N片段）、荧光素酶互补成像（LCI）实验、体内免疫共沉淀（Co-IP）实验以及体外Pull-down实验均证实了AaMYB31.1/2与AaSIZ1之间存在相互作用。

2.5 AaSIZ1介导的AaMYB31s SUMO化增强其蛋白稳定性

体外和体内SUMO化实验证明，AaMYB31.1和AaMYB31.2是SUMO化的底物。通过GPS-SUMO2.0软件预测和点突变实验验证，发现K76是AaMYB31.1和AaMYB31.2 SUMO化的关键位点（K76R突变会破坏SUMO化）。进一步的实验表明，AaSIZ1能够介导AaMYB31s的SUMO化，并且在AaSIZ1存在时，SUMO化水平增强。虽然K76R突变不影响AaMYB31s的转录激活活性和亚细胞定位，但蛋白降解实验表明，SUMO化修饰能显著增强AaMYB31s的蛋白稳定性。在AaSIZ1存在或过表达AaSIZ1的植株蛋白提取物中，AaMYB31s蛋白的降解速度更慢，且蛋白酶体抑制剂MG132能进一步减缓降解，说明AaSIZ1介导的SUMO化通过抑制26S蛋白酶体途径的降解来增强AaMYB31s的稳定性。

2.6 低温胁迫增强AaMYB31s的SUMO化

在低温（4°C）下，AaMYB31s过表达植株中AaMYB31s的SUMO化水平显著高于常温（22°C）。同时，低温处理降低了AaMYB31s的多聚泛素化水平。蛋白稳定性检测发现，低温下AaMYB31.1-GFP和AaMYB31.2-GFP蛋白的降解速度比常温下更慢，而K76R突变体蛋白的降解速度很快且不受温度影响。此外，Co-IP实验显示，低温增强了AaSIZ1与AaMYB31s之间的相互作用。这些结果表明，低温通过增强AaSIZ1与AaMYB31s的互作，进而增强了AaSIZ1介导的AaMYB31s SUMO化，同时降低了其泛素化，最终提高了AaMYB31s的蛋白稳定性。

2.7 AaSIZ1通过促进蜡质合成正向调控耐冻性

在中华猕猴桃中过表达AaSIZ1，发现转基因植株叶片的总蜡质含量和表皮蜡晶沉积在正常和冷胁迫条件下均显著增加。蜡质组分分析显示，总蜡质增加主要源于多种VLCFA衍生物的增加。冷冻表型分析证实，AaSIZ1-OE植株的耐冻性显著增强。此外，与过表达野生型AaMYB31s的植株相比，过表达SUMO化缺陷突变体AaMYB31s^K76R的植株，其蜡质积累和耐冻性虽有提升，但显著弱于前者。这直接证明了AaSIZ1介导的AaMYB31s SUMO化在通过调控蜡质合成以增强耐冻性中的关键作用。

3 讨论

本研究系统阐明了软枣猕猴桃中一个全新的耐冻性调控模块：AaSIZ1-AaMYB31s-AaKCSs。该模块在低温胁迫下被激活，AaSIZ1介导AaMYB31s的SUMO化，增强其稳定性，从而使其能更有效地激活下游蜡质合成基因AaKCSs的表达，促进蜡质积累，最终提高植株的耐冻性。这项工作首次将SUMO化修饰、MYB转录因子调控和蜡质生物合成通路联系起来，揭示了植物应对低温胁迫的一种精细转录后调控机制。研究发现软枣猕猴桃相比中华猕猴桃具有更高效的蜡质合成调控系统，这可能是其具有卓越耐寒性的重要原因。该研究不仅增进了对植物冷适应机制的理解，也为通过分子育种手段（例如操纵AaSIZ1或AaMYB31s基因）培育抗寒性更强的猕猴桃乃至其他作物品种提供了重要的候选基因和理论框架。