《Journal of Biological Chemistry》：Aspartate treatment ameliorates metabolic dysfunction-associated fatty liver disease through upregulation of CBS and suppression of ferroptosis
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本项研究探讨了非必需氨基酸天冬氨酸（ASP）在代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）治疗中的新机制。研究者发现，MAFLD患者及小鼠模型中肝脏ASP水平显著下降。通过膳食或饮水补充ASP可有效改善小鼠由高脂饮食诱导的肝脂肪变性和胰岛素抵抗。机理研究表明，ASP通过上调胱硫醚β-合成酶（CBS）的表达，激活转硫途径，从而增加谷胱甘肽（GSH）合成并抑制铁死亡。研究首次揭示了ASP作为一种新型的铁死亡抑制剂，通过CBS依赖性通路改善MAFLD，为开发新的治疗策略提供了重要依据。
肝脏是我们体内至关重要的代谢器官，但当脂肪在其中过度堆积，便会引发代谢相关脂肪性肝病（MAFLD），这是一种全球范围内日益流行的慢性肝病，并可进一步发展为脂肪性肝炎、肝纤维化甚至肝癌。在探索其发病机制的过程中，氨基酸的代谢失衡被认为扮演着关键角色。其中，非必需氨基酸天冬氨酸（ASP）是嘌呤、天冬酰胺和精氨酸生物合成的关键前体，并与体内重要的抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）的合成密切相关，但其在MAFLD中的具体角色，却像一块未解开的拼图，充满了未知。
过去的研究更多关注于支链氨基酸和芳香族氨基酸在MAFLD中的变化，而对同样重要的非必需氨基酸，尤其是天冬氨酸，却所知甚少。与此同时，一种新近被认识的细胞死亡方式——铁死亡（Ferroptosis），因其与脂质代谢和氧化应激的紧密关联，正成为研究MAFLD等代谢疾病的热点。铁死亡的特点是铁依赖性的脂质过氧化，而转硫途径（Transsulfuration pathway）作为合成谷胱甘肽的关键通路，其失调被认为是铁死亡的代谢特征。那么，在MAFLD中水平下降的天冬氨酸，是否通过调控转硫途径和铁死亡来影响疾病进程呢？这成为了一个亟待回答的科学问题，对于理解MAFLD的病理机制和寻找新的治疗靶点具有重要价值。
为此，来自浙江大学医学院附属第一医院的研究团队进行了一项深入探究。他们的研究首次系统揭示了天冬氨酸在MAFLD中的保护作用及其独特的分子机制，相关成果发表在《Journal of Biological Chemistry》上。
本研究综合运用了临床样本分析、动物模型构建以及多组学技术。研究者首先通过质谱法检测了人类MAFLD患者和小鼠模型的肝脏非必需氨基酸谱。为了验证天冬氨酸的治疗效果，他们构建了高脂饮食（HFD）诱导的MAFLD小鼠模型，并通过在饲料中添加1.25%的天冬氨酸或饮水中添加10 mM天冬氨酸的方式进行干预。此外，还使用了遗传性肥胖的ob/ob小鼠模型以进一步评估疗效。在体外，使用游离脂肪酸（FFA）或棕榈酸（PA）刺激小鼠原代肝细胞诱导脂肪变性模型。研究采用了葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）评估代谢功能，通过Seahorse XF分析仪测量细胞能量代谢表型（即线粒体耗氧率OCR）。为了揭示机制，他们进行了肝脏组织的RNA测序（RNA-Seq）分析和非靶向代谢组学分析。关键靶点蛋白的表达通过蛋白质印迹（Western Blot）进行检测，细胞内的脂质活性氧（ROS）水平使用C11-BODIPY探针并通过流式细胞术进行定量，谷胱甘肽（GSH）含量则使用商业试剂盒测定。为了验证铁死亡的作用，研究中使用了特异性的铁死亡抑制剂Liproxstatin-1。
研究结果
1. ASP水平在MAFLD患者和小鼠中降低
研究团队通过质谱分析发现，在人类MAFLD患者和高脂饮食喂养的小鼠肝脏中，天冬氨酸是唯一一致且显著减少的非必需氨基酸。血清中的天冬氨酸水平也相应下降。在肝细胞内，天冬氨酸的浓度最高，而用游离脂肪酸刺激原代肝细胞诱导脂肪变性后，细胞内的天冬氨酸含量也随之降低。有趣的是，当在培养基中添加天冬氨酸（5 mM）时，能够显著改善由游离脂肪酸或棕榈酸诱导的肝细胞脂质积累。这些数据表明，肝脂肪变性与游离脂肪酸诱导的天冬氨酸水平下调有关。
2. 补充ASP减轻HFD诱导的小鼠MAFLD
为了探究补充天冬氨酸的益处，研究人员在高脂饮食中添加了1.25%的天冬氨酸。结果显示，补充天冬氨酸有效逆转了高脂饮食导致的小鼠肝脏天冬氨酸浓度下降。虽然研究结束时各组小鼠体重相当，但天冬氨酸干预组的小鼠肝脏重量与体重比值、反映肝损伤的丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平以及肝内甘油三酯（TG）含量均显著降低。肝组织切片（H&E和油红O染色）也直观地证实了天冬氨酸对高脂饮食诱导的肝脂肪变性的改善作用。此外，天冬氨酸处理还下调了肝脏中与脂肪合成相关的基因（如SREBP1c， FAS， ACC， CIDEA）的mRNA和蛋白表达水平。重要的是，长期补充天冬氨酸并未影响血清肌酐、尿素氮、肌酸激酶或乳酸脱氢酶水平，表明其具有较好的安全性。通过饮水补充天冬氨酸（10 mM）也观察到了类似的改善效果。
3. 补充ASP改善MAFLD小鼠的葡萄糖稳态和胰岛素敏感性
胰岛素抵抗是MAFLD的常见表现。研究发现，膳食补充天冬氨酸显著改善了高脂饮食小鼠的葡萄糖不耐受（GTT）和胰岛素抵抗（ITT），降低了空腹血浆胰岛素水平和胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。同时，天冬氨酸还使高脂饮食引起的高肝糖原含量恢复正常。通过饮水补充天冬氨酸同样改善了高脂饮食小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。这些结果表明，天冬氨酸能增强高脂饮食小鼠的胰岛素敏感性。
4. 补充ASP改善MAFLD中的线粒体功能
鉴于天冬氨酸的主要功能是为线粒体中的三羧酸循环提供氨基，研究者评估了其对线粒体功能的净效应。利用Seahorse XF细胞能量表型测试，他们发现与仅用游离脂肪酸处理的对照组相比，天冬氨酸处理的游离脂肪酸培养的原代肝细胞的耗氧率显著增加，表明线粒体氧化能力增强。游离脂肪酸处理降低了最大呼吸、备用呼吸能力和ATP相关呼吸，而这些都因天冬氨酸的补充而得到部分恢复。与氧化磷酸化的改善一致，天冬氨酸补充挽救了由游离脂肪酸或高脂饮食诱导的肝脏UQCRC2（线粒体复合物III的一个组分）表达的降低。
5. ASP通过增加CBS表达抑制肝脂肪变性
为了全面了解肝脏对天冬氨酸的转录组反应，研究者进行了RNA测序分析。基因本体（GO）富集分析显示，天冬氨酸补充显著改变了高脂饮食喂养小鼠肝脏中与硫化合物代谢过程和硫化合物结合相关的通路。在转硫途径的关键酶中，胱硫醚β-合成酶（CBS）被确定为天冬氨酸作用的主要下游靶点。代谢组学分析显示，与高脂饮食组相比，天冬氨酸补充组的肝脏中甲硫氨酸和胱硫醚水平更高，而中间产物S-腺苷甲硫氨酸水平更低，表明天冬氨酸可能调节转硫途径。体内外实验均证实，天冬氨酸补充上调了脂肪变性肝细胞中CBS的蛋白水平。由于转硫途径对谷胱甘肽合成至关重要，其受损会导致谷胱甘肽耗竭和关键的铁死亡抑制酶——谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）失活，研究者假设天冬氨酸通过调节铁死亡来减轻肝脏脂肪变性。实验证实，游离脂肪酸刺激显著增加了原代肝细胞中的脂质活性氧（铁死亡的标志），而天冬氨酸处理减弱了这种增加。同时，天冬氨酸补充阻止了高脂饮食小鼠肝脏中GPX4表达的下调。最后，用CBS抑制剂氨基氧乙酸（AOAA）处理，完全消除了天冬氨酸诱导的游离脂肪酸处理肝细胞中谷胱甘肽含量的增加。这些数据表明，天冬氨酸通过上调CBS表达来抑制MAFLD进展，其机制很可能涉及转硫途径和铁死亡的抑制。
6. 铁死亡抑制剂可消除ASP诱导的对肝脏脂质含量和胰岛素敏感性的改善
为了进一步验证天冬氨酸特异性抑制铁死亡，研究人员使用了脂质过氧化特异性抑制剂Liproxstatin-1。Liproxstatin-1处理显著改善了高脂饮食小鼠的肝脏重量、血清肝损伤标志物、葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。值得注意的是，在已用Liproxstatin-1处理的高脂饮食小鼠中，补充天冬氨酸并未对这些参数带来额外益处。同样，在原代肝细胞中，Liproxstatin-1显著降低了细胞内甘油三酯，但在与天冬氨酸共处理的细胞中，这种效应消失。这些数据证明，天冬氨酸对MAFLD的改善作用依赖于对铁死亡的抑制。
7. ASP补充作为小鼠MAFLD的治疗策略
在遗传性肥胖模型（ob/ob小鼠）中，通过饮水补充天冬氨酸同样显著降低了体重、肝脏重量、腹部脂肪量以及肝脏损伤标志物，减轻了肝脏脂质积累，并显著下调了关键脂肪生成基因的mRNA和蛋白表达水平。这些发现表明，天冬氨酸补充在遗传性肥胖小鼠中也抑制了MAFLD的进展。
研究结论与意义
本研究得出了一系列重要结论。首先，研究证实天冬氨酸（ASP）补充能减轻MAFLD小鼠的肝脏脂质堆积。更重要的是，研究首次揭示了其背后的核心机制：天冬氨酸通过上调胱硫醚β-合成酶（CBS）的表达，激活转硫途径，从而增加细胞内的谷胱甘肽（GSH）水平，并有效抑制了铁死亡这一细胞死亡过程。进一步的验证实验表明，使用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1可以模拟天冬氨酸的益处，而当天冬氨酸与抑制剂联用时，其改善作用不再叠加，这强有力地证明天冬氨酸对MAFLD的改善作用正是通过抑制铁死亡来实现的。此外，研究还发现天冬氨酸能改善胰岛素敏感性、抑制脂肪生成，并部分增强线粒体呼吸功能。
这项研究的意义在于，它首次将天冬氨酸的缺乏与MAFLD中铁死亡的激活联系起来，并明确了CBS是这一过程的关键中介分子。这不仅为理解MAFLD的病理机制提供了新的视角——即氨基酸代谢紊乱（特别是天冬氨酸缺乏）通过转硫途径-铁死亡轴驱动疾病进展，更重要的是，它指出了天冬氨酸作为一种潜在治疗药物的新价值。天冬氨酸本身已在临床上用于治疗肝炎和肝硬化，具有良好的安全性基础。本研究为其“老药新用”治疗MAFLD提供了坚实的临床前证据和明确的分子靶点（CBS-铁死亡通路），为开发针对MAFLD的新型治疗策略开辟了有前景的方向。未来，设计严谨的人体干预性研究将是推动天冬氨酸走向临床应用的关键一步。
