高效蛋白质UFM化修饰方法的优化及其在人类细胞底物大规模鉴定中的应用

《Journal of Biological Chemistry》：Optimization of protein UFMylation modification method and its application in substrate identification in human cells

本研究旨在攻克UFM化修饰底物检测效率低、特异性差的技术瓶颈。研究人员通过构建UFSP1KO/UFSP2KO双敲除HEK293T细胞模型，结合E3连接酶组分UFL1与DDRGK1的优化表达，显著提升了蛋白质UFM化水平。他们进一步利用特异性识别UFM1残留基序（K-ε-GV）的抗体富集修饰肽段，通过LC-MS/MS技术一次性鉴定了超过600个UFM化底物。该研究建立了一套高效、特异、可靠的UFM化底物研究平台，为深入探究其生物学功能及调控机制奠定了坚实基础。

　　

在生命活动的微观世界里，蛋白质不仅是构建细胞的基础材料，更是执行生命功能的“分子机器”。为了让这些机器能够精准地响应不同的指令、适应多变的环境，细胞进化出了一套精密的“分子开关”系统——翻译后修饰（Post-translational modifications, PTMs）。这就像给蛋白质贴上各式各样的“功能标签”，通过改变其活性、定位或稳定性，从而调控几乎所有的细胞过程。泛素（Ubiquitin）及泛素样（Ubiquitin-like, UBL）蛋白介导的修饰，是其中至关重要的一类。

在UBL家族中，泛素折叠修饰因子1（Ubiquitin-fold modifier 1, UFM1）及其介导的UFM化修饰，近年来被发现是维持细胞稳态的关键调节因子。与泛素化类似，UFM化也通过E1（激活酶）-E2（结合酶）-E3（连接酶）的级联反应进行：UBA5作为唯一的E1酶启动UFM1的活化，UFC1作为唯一的E2酶协助活化UFM1的转移，而UFL1/DDRGK1/CDK5RAP3三元复合体则作为核心的E3连接酶，负责将UFM1共价连接到靶蛋白的赖氨酸（Lys, K）残基上。此外，UFM1从其前体形式（pro-UFM1）的成熟以及UFM1偶联物的移除（去UFM化），均由UFM1特异性蛋白酶（UFM1-specific proteases, UFSPs）催化。

越来越多的证据表明，UFM化过程的失调与多种疾病密切相关，包括癌症、造血缺陷、骨骼发育不良和早发性脑病等。尽管UFM化在核糖体质量控制、内质网应激反应和肿瘤抑制等关键生物学过程中的作用日益受到认可，但其功能机制的研究却长期受制于一个主要瓶颈——已知的UFM化底物蛋白数量极其有限。截至本研究前，已报道的UFM化底物不足30个，远少于泛素化或SUMO化等其他成熟的UBL修饰系统。这种匮乏源于两大技术挑战：一是核糖体蛋白L26（RPL26）是细胞内最主要的UFM化底物，其与UFM1的偶联物占据了细胞内UFM1的绝大部分，从而在使用抗UFM1抗体检测时会掩盖低丰度底物的信号；二是传统的UFM化检测方法通常需要共转染多个UFM化组件，操作繁琐、易产生波动，并且在富集UFM化肽段方面缺乏特异性。因此，深入理解UFM化的生物学功能及其调控网络面临巨大困难，目前也缺乏用于预测UFM化位点的计算工具。

为了突破这些限制，来自杭州师范大学的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》上发表了一项重要研究。他们旨在开发一套系统性的策略，以改进UFM化检测方法，并实现底物的大规模鉴定。他们的核心目标是建立一个更高效、特异和可靠的UFM化底物研究平台。

研究人员运用了多项关键技术方法来推进研究。首先，他们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在人类HEK293T细胞中构建了UFSP2单敲除（UFSP2^KO）以及UFSP1/UFSP2双敲除（UFSP1^KO/UFSP2^KO, DKO）细胞系。其次，通过单因素实验优化转染体系，确定了E3连接酶组分UFL1和DDRGK1对于最大化UFM化效率的关键作用。最后，他们将优化后的细胞系统与一种新开发的、特异性识别UFM1残留基序（K-ε-GV）的抗体相结合，利用液相色谱-串联质谱（Liquid chromatography–tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）技术进行高通量分析，实现了UFM化肽段的强力富集与鉴定。整个研究基于HEK293T这一人类胚胎肾细胞系模型展开。

研究结果

1. 构建UFM1特异性蛋白酶敲除细胞系

早期研究认为UFSP2是人类细胞中唯一负责pro-UFM1成熟和去UFM化的功能性蛋白酶。然而，本研究团队及其他课题组独立证实，UFSP1同样具有强大的蛋白酶活性，并参与pro-UFM1加工和从偶联底物上移除UFM1的过程。蛋白质UFM化的启动需要UFSP1和UFSP2对pro-UFM1进行成熟化加工。因此，研究人员旨在构建一个缺乏UFM1特异性蛋白酶的细胞系，从而完全废除UFM化和去UFM化过程。当外源引入具有暴露的羧基末端甘氨酸83（Gly⁸³）残基的成熟形式UFM1（UFM1ΔC2）时，UFM化过程得以恢复，而去UFM化过程仍然存在缺陷。他们推断这一策略可能建立一个更有效的系统来研究细胞中底物蛋白的UFM化。

研究团队首先利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术在HEK293T细胞中敲除了UFSP2基因。蛋白质印迹（Western blotting）分析结果显示，在UFSP2^KO细胞系中，蛋白质UFM化水平显著增加，主要检测到UFM1偶联的RPL26条带。随后，他们利用UFSP2^KOHEK293T细胞系进一步敲除UFSP1基因，产生了UFSP1^KO/UFSP2^KO细胞系。实验结果表明，底物蛋白的UFM化被完全废除，同时未偶联的UFM1发生积累。此外，通过桑格（Sanger）测序证实了UFSP1和UFSP2基因中存在移码突变。这些结果证明，成功构建了可用于研究UFM化的两种极端状态（高UFM化与无UFM化）的细胞模型。

2. 在UFSP1^KO/UFSP2^KO双敲除细胞系中改进蛋白质UFM化检测

利用构建的敲除细胞系，研究人员尝试用他们的策略探索底物蛋白的UFM化状态。他们参考已报道的蛋白质修饰方法，为人类细胞中的底物蛋白提供了优化的UFM化检测方案。他们选择了三个已报道的UFM化底物——ASC1、RPL26和肿瘤抑制蛋白p53进行实验验证。

使用该方案，他们分别在UFSP2^KO、UFSP1^KO/UFSP2^KO和野生型（WT）HEK293T细胞中检测了ASC1、RPL26和p53的UFM化。由于UFSP2的缺失导致UFM化蛋白的剧烈积累，他们观察到在UFSP2^KO细胞中，外源转染的三个底物的UFM化水平高于WT细胞。令人欣喜的是，与UFSP2^KO细胞的结果相比，在UFSP1^KO/UFSP2^KO细胞中，这些底物的UFM化状态信号更佳，包括更强的UFM1偶联条带和更明显的多聚UFM1偶联物。此外，他们观察到外源FLAG标签底物在UFSP2^KO细胞中的蛋白水平低于其他两组，这可能是由于UFSP2^KO细胞中持续的高水平UFM化状态所致。相比之下，UFSP1^KO/UFSP2^KO和WT细胞之间外源FLAG标签底物的表达没有显著差异。这些结果证实了该策略的可行性，并且UFSP1^KO/UFSP2^KO细胞更有利于蛋白质UFM化研究。通过将UFM1ΔC2和底物质粒共转染到缺乏UFM1特异性蛋白酶的UFSP1^KO/UFSP2^KO细胞中，可以实现更高的UFM化水平。

3. 外源表达E3连接酶复合体组分UFL1和DDRGK1促进蛋白质UFM化

先前报道的UFM化蛋白质修饰方法倾向于共转染底物质粒与多个UFM化组件。为了确定在UFSP1^KO/UFSP2^KO细胞中进行底物UFM化检测所需的最佳UFM化组件组合，研究人员采用了单因素实验。

在DKO细胞中，当仅转染空载体时，内源性UFM化被完全阻断；而当转染成熟的UFM1ΔC2时，UFM化得以恢复。基于此，他们建立了包含所有关键UFM化组件（UBA5、UFC1、UFL1和DDRGK1）的共转染组作为阳性对照。结果显示，转染混合物中是否存在UBA5或UFC1对细胞内UFM化水平几乎没有影响。相比之下，外源表达UFL1和DDRGK1在调节细胞内UFM化水平方面起着显著作用。

为了进一步阐明E3连接酶复合体组分UFL1和DDRGK1在UFSP1^KO/UFSP2^KO细胞底物修饰中的作用，他们利用单因素实验和免疫沉淀对ASC1进行了UFM化检测。结果表明，缺少UFL1或DDRGK1会导致ASC1的UFM化水平显著下降，而UFL1和DDRGK1的存在足以支持相当水平的UFM1偶联ASC1。同时，他们利用主要的细胞内UFM化底物RPL26重复了这些单因素实验，并得到了一致的结论。综上所述，这些实验证明E3连接酶组分UFL1和DDRGK1对于增强细胞内UFM化水平至关重要，并且它们的外源共表达进一步促进了UFSP1^KO/UFSP2^KO细胞中的底物UFM化。

4. 在HEK293T细胞中鉴定和验证UFM化底物

迄今为止，只有有限数量的UFM化底物被鉴定，已报道的不足30个。这种稀缺性限制了对UFM化生物学功能的理解。此外，研究人员发现，外源表达的UFL1、DDRGK1和UFM1ΔC2在UFSP1^KO/UFSP2^KO细胞（DKO-ΔC2）中表现出显著升高的UFM化水平。

为了实现细胞内UFM化底物的大规模鉴定，他们开发了一种高效方法，利用K-ε-GV抗体高效富集UFM1修饰的肽段，并最终采用LC-MS/MS在DKO-ΔC2样品中特异性鉴定UFM化位点。UFM化会在靶标赖氨酸（K）残基上引起+156.09 Da的特异性质量位移，这源于UFM1 C末端酶切后产生的甘氨酸-缬氨酸（GV）二肽残留物的共价连接。令人惊讶的是，他们鉴定出了超过600个底物，这个数字远远超过先前报道的数量。重叠的底物包括了核心的UFM化组分和几个先前报道的底物。此外，鉴定出的偶联位点与之前的发现一致，进一步验证了他们数据的稳健性。

随后，他们从列表中选择五个代表性蛋白（HSP90α、YEATS2、ANXA5、ANXA6、PRMT5）进行进一步验证，发现所有候选蛋白都能被UFM1分子偶联，并且它们的修饰能被UFSP2去偶联。此外，内源性修饰测定的结果进一步证实了这五个候选蛋白确实是UFM化底物。简而言之，这些结果证明了成功开发了一种可靠的策略，用于大规模鉴定细胞内UFM化底物。

目前，对于泛素化和SUMO化等PTM已有可用的位点预测工具，但对于UFM化位点则没有。这一限制归因于已知的UFM化底物数量较少。根据他们的LC-MS/MS数据，研究人员试图通过使用基于基序的序列分析工具检查UFM1残留的K-ε-GV序列片段，来分析特定赖氨酸残基的修饰模式。他们的分析表明，与赖氨酸和精氨酸（Arg, R）残基相比，在被UFM1偶联的靶标赖氨酸残基相邻位置（上游或下游一个残基）的甘氨酸残基和酪氨酸（Tyr, Y）残基的保守性更高。此外，他们研究了这些底物的亚细胞定位，结果显示UFM化底物主要定位于细胞质和质膜。功能注释分析表明，UFM化底物主要参与多个细胞通路，包括翻译、核糖体结构和生物合成、细胞内运输、分泌和囊泡运输。总的来说，这些数据为开发UFM化位点预测工具的基序或位点奠定了基础，并为未来研究UFM化功能提供了关键见解。

研究结论与讨论

本研究成功建立了一个高效、可靠的UFM化研究平台。通过构建UFSP1^KO/UFSP2^KO双敲除HEK293T细胞系，并优化外源表达E3连接酶组分UFL1和DDRGK1，研究人员显著提升了蛋白质UFM化水平，克服了传统方法效率低、不稳定的问题。最重要的是，他们利用特异性识别UFM1残留基序（K-ε-GV）的抗体结合LC-MS/MS技术，实现了UFM化底物的大规模鉴定，一举将已知底物数量从不足30个扩展到超过600个，取得了突破性进展。

这项工作不仅为UFM化研究提供了强大的技术工具，而且通过生物信息学分析，初步揭示了UFM化位点周围的氨基酸偏好性以及底物蛋白的亚细胞定位和功能富集情况，为理解UFM化的功能调控网络提供了宝贵的数据集和理论依据。该研究建立的方法学未来可应用于更具特定生物学或病理学背景的细胞模型，有助于筛选与目标生物过程或疾病条件更相关的UFM化底物候选分子，从而为深入探究UFM化在人类健康和疾病中的分子机制提供强有力的技术支持。尽管研究存在一些局限性，例如主要基于HEK293T细胞系以及可能遗漏某些低丰度底物，但其建立的高效鉴定策略无疑将为整个UFM化研究领域打开新局面，推动对该重要翻译后修饰系统的功能探索进入一个更广阔的天地。