通过生物信息学设计并表达杀菌渗透性增强蛋白（BPI），以中和脂多糖（LPS）的细胞毒性作用

BPI53基因密码子优化后在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，纯化蛋白显示强LPS结合能力（EC50:1.3μg/mL）和显著抗炎活性，可降低NO、TNF-α及IL-6等促炎因子水平，同时调节IL-10等抗炎因子表达，证实其作为革兰氏阴性菌败血症治疗候选物的潜力。

　　

摘要

BPI（细菌内毒素结合蛋白）由多形核白细胞产生，通过与脂多糖（LPS）高亲和力结合而表现出强烈的抗菌活性。本研究旨在原核系统中表达功能性重组人BPI（BPI53），以评估其作为治疗LPS诱导炎症的潜在疗效。BPI53基因经过密码子优化以适应原核表达，并被克隆到E. coli BL21菌株中。使用通用pET引物进行菌落PCR实验，确认了转化的成功。通过添加1 mM IPTG诱导蛋白质表达，并使用Ni–NTA亲和柱在天然条件下纯化BPI53。利用抗His标签抗体进行Western blotting实验，验证了重组蛋白的表达。通过ELISA检测LPS结合能力，同时通过商业ELISA试剂盒测量LPS刺激的初级腹膜巨噬细胞中的促炎和抗炎细胞因子（TNF-α、ILs和NO）来评估抗炎活性。密码子优化将密码子适合度（CAI）从0.61提高到0.81，使GC含量达到51.52%，并提高了mRNA稳定性（ΔG值为–443.7 kcal/mol）。优化后的序列没有串联重复序列或GC富集区域，且在5′起始位点附近具有较少的二级结构。优化后的BPI53序列在E. coli BL21(DE3)菌株中成功表达；SDS-PAGE和Western blotting实验确认存在约53 kDa的蛋白质条带。ELISA结果显示，BPI在312 ng/mL浓度下对LPS的结合亲和力为OD: 0.41（EC??值为1.3 μg/mL）。功能实验表明，400 ng/mL浓度的BPI53显著降低了LPS诱导的一氧化氮、IL-10和TNF-α的产生，并调节了IL-1β和IL-6的水平，显示出可测量的LPS中和活性。生物信息学设计使得功能性人BPI53在E. coli中的成功表达成为可能。该重组蛋白表现出强烈的LPS结合能力和抗炎活性，显示出其作为治疗革兰氏阴性菌败血症的具有成本效益的疗法的潜力。