《Journal of Chromatography B》：Resolving Biclonal Gammopathy from monoclonal patterns: Diagnostic utility of triple quadrupole mass spectrometry in the era of therapeutic monoclonal antibodies
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该研究通过液相色谱-三重四极杆质谱联用技术结合免疫富集法，分析14份血清样本中双带现象的成因。结果显示：7份IgG样本中2例为真双克隆，3例为单克隆伴结构变异（糖基化差异）；6份IgA样本均为单克隆；1份IgMκ样本为双克隆。该方法成功区分了单克隆、双克隆、单抗干扰（ Daratumumab）及糖基化变异，证实质谱技术可提升γ-珠蛋白病诊断准确性。
作者：Ankitha K. Puthiyaveettil、Sujay Ramaprasad、Deepalakshmi D. Putchen
研究机构：Neuberg Anand Academy of Laboratory Medicine Pvt Ltd，印度班加罗尔
摘要
双克隆丙种球蛋白病在大约1%的骨髓瘤病例中被观察到，通常通过血清蛋白电泳（SPEP）和免疫固定电泳（IFE）进行检测。当两条带具有相同的重链-轻链同型时（例如IgGκ/IgGκ），解读结果会变得具有挑战性，因为仅凭视觉评估可能会错误地分类克隆性。这种模式可能由结构异常的免疫球蛋白变体（二聚体、翻译后修饰）、治疗性单克隆抗体（tMAb）的干扰或真正的双克隆性引起。在这项研究中，采用了液相色谱-三重四极杆质谱（LC-TQMS）技术来测定轻链的质量，并以高特异性区分这些可能性。14份在IFE上显示相同同型双带的残余血清样本首先使用骆驼科动物抗体包被的琼脂糖珠进行同型特异性免疫富集，然后进行化学还原和LC-TQMS分析。κ轻链的质量范围为22,973–23,574 Da，而更高的κ轻链质量（24,284 Da和25,942 Da）出现在IgM同型中。λ轻链的质量介于22,604至22,820 Da之间。在7份IgG样本中，有2份样本确认为双克隆性，3份为单克隆性，2份为tMAb干扰（达拉妥单抗）。所有6份IgA样本均为单克隆性，而1份IgM样本显示双克隆性。IgG和IgM轻链分别观察到了糖基化（己糖Δm 162 ± 10 Da，唾液酸化Δm 292 ± 10 Da）。因此，LC-TQMS方法有效地区分了双带病例，明确了双克隆性、单克隆性、tMAb干扰和结构变异。
影响声明
1) 解决了血清蛋白电泳或免疫固定电泳中显示双带模式的诊断不确定性。
2) 提供了轻链的精确质量信息，以实现准确表征。
3) 能够区分双克隆性、单克隆性、治疗性干扰和糖型。
4) 展示了治疗性单克隆抗体或结构异常的免疫球蛋白变体（如糖基化）如何使单克隆模式的解读复杂化。
5) 降低了误分类的风险，提高了诊断准确性和患者管理。
6) 通过将分子精度整合到常规临床工作中，推动了实验室诊断的发展。
引言
浆细胞异常是一组异质性疾病，其特征是分泌免疫球蛋白的浆细胞克隆扩增[1]，通常在循环中表现为单克隆免疫球蛋白（M蛋白）[2]。虽然大多数疾病涉及单个浆细胞克隆，但有一小部分病例表现出相同重链和轻链同型的双带，例如IgGκ或IgMκ类型。这些模式在常规检测方法（如血清蛋白电泳（SPEP）[3]和免疫固定电泳（IFE）[4]中可能表现为双克隆性，尽管潜在的克隆性可能涉及单个克隆，无论是否有治疗性干扰或结构变异。真正的双克隆性是指由两个不同的浆细胞克隆产生两种不同重链-轻链组合的免疫球蛋白，例如IgGκ与IgAλ或IgMλ与IgGλ或IgMκ，这代表了与相同同型双带不同的生物学现象[5]。
在SPEP中，双克隆性通常通过β2或γ区域出现两个明显的M峰来提示。然而，聚合的免疫球蛋白（特别是IgM和IgA）可能会产生人为的双M峰。使用还原剂（如β-巯基乙醇（βME）处理可以将其分解为单个单克隆带，从而揭示真实的潜在模式。Orr等人[6]在IgM丙种球蛋白病中展示了这种方法，βME处理有助于检测和分类单克隆蛋白，因为聚合形式在IFE中会显示为多个带。尽管这些技术很有用，但电泳和免疫固定技术无法可靠地区分翻译后修饰的形式（糖基化轻链）、治疗性单克隆抗体的干扰或构象变化，这是常规实践中的一个关键诊断空白。
此外，IFE检测到的双克隆性的生物学有效性往往不确定，因为许多最初被报告为双克隆性的病例实际上是单克隆性的，涉及结构变异（如糖基化）和治疗性单克隆抗体的干扰[7]。例如，用于治疗多发性骨髓瘤的抗CD38抗体达拉妥单抗（IgGκ同型）在IFE中可能表现为离散的IgGκ带。这些治疗相关带可能与内源性单克隆蛋白非常相似，导致误判为第二种M蛋白。在基于单克隆抗体的治疗时代，这种干扰变得越来越重要，强调了需要补充方法来准确确定克隆性[8]。
质谱（MS）凭借其高分析灵敏度和特异性，已成为检测和表征单克隆丙种球蛋白病的有效技术。与IFE相比，MS具有更高的特异性和灵敏度[9]，因为它可以测定完整轻链的质量，准确区分单克隆性和双克隆性模式以及治疗性干扰[10]。尽管越来越多的证据支持质谱的诊断效用，但专门针对相同同型双克隆丙种球蛋白病的研究仍然较少。Fatica等人[7]表明，结合MALDI-TOF MS（Mass-Fix）的免疫富集可以区分单克隆蛋白的单体-二聚体形式、治疗性单克隆抗体的干扰、轻链糖基化或真正的双克隆蛋白。在他们的研究队列中，大多数在IFE中显示为双克隆性的样本在MS重新检测时实际上是单克隆性的，占IgG病例的67%和IgA病例的93%，只有少数为双克隆性丙种球蛋白病。这些发现突显了仅依靠电泳方法可能导致的误分类率高，并强调了补充方法在M蛋白表征中的价值[7]。
MALDI-ToF MS结合了样品制备和自动化分析，已经在一些临床实验室中取代了IFE[11]。对于模糊或阴性的MALDI-MS结果，可以进一步使用高分辨率质谱（HRMS）进行检测，后者能更精确地检测低丰度或复杂的单克隆物种，包括那些被tMAb干扰掩盖的物种[12]。由于仪器和维护成本高昂，许多诊断实验室无法使用HRMS。我们实验室配备了三重四极杆质谱（TQMS），通常用于测量小分子（包括治疗药物、类固醇激素和其他代谢物）[13][14][15][16]，这促使我们探索其用于测量轻链质量的可能性。我们实验室的初步研究表明，可以检测到双克隆性、单克隆性、达拉妥单抗的干扰和糖基化轻链[17][18]。
本研究旨在评估相同同型双带的克隆性，并强调达拉妥单抗（tMAb）和轻链翻译后修饰（糖基化）在M蛋白解读中带来的诊断挑战。
伦理批准
本研究得到了机构人类伦理委员会的批准（批准编号：EC/NEW/INST/2022/2627）。该项目的具体批准编号为NAALM/EC/3.3/03–2022。由于仅分析了匿名残余血清样本，委员会免除了患者同意的要求。
样本
样本来自2022年1月至2025年4月期间的患者残余血清。选择这些样本的标准是存在双带模式。
结果
本研究分析了14份在IFE上显示相同同型（G,A,M）和轻链（κ,λ）双带的患者血清样本。样本包括10名男性和4名女性，年龄范围为52至89岁。其中有7份IgG样本（6份IgGκ和1份IgGλ）、6份IgA样本（4份IgAκ和2份IgAλ）以及1份IgMκ样本。在2份IgG样本（S3和S5）和2份IgA样本（S8和S12）中，由于双带持续存在，被诊断为双克隆性。
讨论
IFE上相同同型双带的解读是一个公认的诊断挑战。在某些样本中，使用β-巯基乙醇（βME）处理后，这些双带分解为单个单克隆成分，证实它们来自同一克隆[3][4]。在使用tMAb的情况下，情况更加复杂，特别是IgGκ抗体，因为它们在IFE中会产生额外的带，可能模仿双克隆性或掩盖内源性克隆。反射检测
人工智能辅助
作者使用ChatGPT（OpenAI）帮助起草和修改手稿的某些部分。所有科学内容、数据解读和结论均由作者完成和验证。
作者贡献声明
Ankitha K. Puthiyaveettil：撰写原始草稿、项目管理、方法学、研究、正式分析。
Sujay Ramaprasad：撰写和编辑、资源管理、概念构思。
Deepalakshmi D. Putchen：撰写和编辑、撰写原始草稿、监督、项目管理、方法学、研究、正式分析、概念构思。
资金
本研究未申请任何资金。
利益冲突声明
作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：Sujay Ramaprasad与Neuberg Anand Academy of Laboratory Medicine Pvt. Ltd.有关联，包括股权或股票。所有其他作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢A. Prajwal博士在双带模式解读方面的有益讨论，感谢S. Priyanka女士协调样本收集，感谢A. Saikumar先生对患者数据的匿名处理，以及实验室技术人员的支持。作者还感谢Thermo Fisher Scientific Pvt. Ltd.提供的κ和λ轻链珠，以及Waters (India Pvt. Ltd.)提供的去卷积软件（MaxEnt1）。
