Fe/N掺杂的中空碳纳米酶通过重塑肿瘤微环境实现协同化的化学-光热-催化疗法

《Journal of Colloid and Interface Science》：Fe/N-doped hollow carbon nanozymes for synergistic chemo-photothermal-catalytic therapy via tumor microenvironment remodeling

肿瘤微环境氧化应激增强型多模态治疗纳米系统开发及其协同机制研究。通过掺杂Fe3+和N原子构建FeNHC-PEG纳米酶，表面修饰聚乙二醇提高生物相容性，载药于多孔碳结构实现化疗递送。该纳米系统具有过氧化氢酶（POD）样和氧化酶（OXD）样双重酶模拟活性，通过分解谷胱甘肽产生羟基自由基增强氧化应激，同时近红外光热转化效率达65%，局部升温至48-60℃促进细胞凋亡。实时剪切波弹性成像证实光热-氧化应激协同作用显著降低肿瘤硬度（下降37.2±2.1%），促进药物渗透和化疗敏感性提升（抑制率95.8%±1.8%）。动物实验显示系统具有优异靶向性和低系统性毒性。研究提出金属掺杂碳基纳米酶协同光热治疗与化疗的三重协同机制，为肿瘤微环境重塑提供新策略。

　　

程辉|余彤|王艳红|赵阳|赵勤富|冯慧芬

中国郑州大学第五附属医院

摘要

由于肿瘤微环境（TME）的独特病理生理条件，化疗药物的渗透性和疗效受到限制，这仍然是治疗中的一个主要障碍。近年来，人们越来越关注通过调节TME来克服这些障碍，从而为提高癌症治疗效果提供了有希望的方法。为了解决这一挑战，开发了一种多功能纳米粒子系统（DOX/FeNHC-PEG），用于增强氧化应激的三模式疗法。该系统通过将Fe³⁺离子和氮原子掺入空心碳纳米结构中构建，并通过NH?-PEG对表面进行功能化处理，随后将多柔比星（DOX）加载到其中孔隙中。FeNHC-PEG纳米酶表现出显著的多酶模拟活性，消耗内源性谷胱甘肽的同时，通过类似过氧化物酶（POD）和氧化酶（OXD）的活性产生大量的自由基（OH），从而加剧肿瘤的氧化应激。此外，这种纳米酶在近红外（NIR）照射下表现出优异的光热转换效率。重要的是，实时剪切波弹性成像（SWE）显示，光热疗法（PTT）和活性氧（ROS）的联合效应通过降解细胞外基质成分显著降低了肿瘤的粘弹性。这一变化不仅增强了肿瘤内药物的渗透性，还与持续的氧化应激共同作用，重塑了肿瘤微环境，最终显著提高了对DOX的化学敏感性。同时，局部高温进一步增强了酶样活性，促进了ROS的生成。体内研究表明，DOX/FeNHC-PEG表现出出色的生物相容性，并具有强烈的肿瘤生长抑制作用（95.8% ± 1.8%的抑制率），且全身毒性极低。这种三重协同疗法系统代表了肿瘤微环境重塑的创新方法，具有相当大的转化潜力。

引言

恶性肿瘤对人类健康构成了普遍威胁，是现代临床实践中最具挑战性的领域之一。尽管取得了进展，但传统治疗方法存在固有的局限性，导致癌症治疗仍面临诸多困难，包括早期诊断困难、手术并发症和药物耐药性。几种新型癌症疗法因其非侵入性、高选择性和显著降低药物耐药性而脱颖而出。值得注意的例子包括免疫疗法[1]、化学动力学疗法[2]、光动力疗法[3]和光热疗法（PTT）[4]、[5]。在新兴的癌症治疗方法中，PTT利用近红外（NIR）光响应的光热纳米材料将光能高效转化为热能，从而诱导肿瘤热损伤[6]、[7]。然而，诱导的高温可能会损害肿瘤周围正常组织的完整性。此外，PTT的疗效还受到NIR光穿透深度浅和纳米材料光热转换效率不足的限制[8]、[9]。

为了解决上述问题，推荐使用具有优异性能的外源性光热纳米材料进行抗肿瘤治疗。肿瘤部位的温度强度和持续时间反映了所应用的治疗效果。当温度达到41–48°C时，内源性蛋白质会展开并重新组装，对激光照射和化疗药物变得高度敏感；当温度达到48–60°C时，肿瘤组织会迅速发生不可逆损伤。光热纳米剂对于发挥和增强光热治疗效果至关重要。虽然金属硫化物、金纳米颗粒和小分子有机染料常被用作光热剂，但其效率仍不尽如人意。因此，研究人员转向了新型纳米材料——如介孔碳[10]、石墨烯[11]、纳米片[12]和金属有机框架[13]——这些材料具有较大的表面积、优越的光学特性和优化的结构，可以提高PTT的效果。

除了作为光热剂外，基于碳的纳米材料还表现出多种酶模拟活性。高等人首次发现磁性氧化铁纳米颗粒（Fe₃O₄ NPs）在2007年具有内在的辣根过氧化物酶（POD）样活性，能够调节缺氧并诱导肿瘤细胞凋亡[14]。此后，纳米酶被定义为一类具有类似酶催化功能的纳米材料，由于具有高催化效率、显著的稳定性和易于大规模合成，相比天然酶具有独特优势。纳米酶包括多种类型，如POD样[15]、[16]、[17]、氧化酶（OXD）样[18]、[19]、[20]、[21]和超氧化物歧化酶（SOD）样纳米酶[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。在这些纳米酶中，氮掺杂的基于碳的纳米酶特别值得关注，因为氮元素在稳定和结合底物方面起着关键作用，类似于天然酶及其辅因子的功能。由于基于碳的纳米酶在电子转移过程中存在显著障碍以及相对较低的酶反应速率，其在生物医学领域的应用受到严重限制。因此，优化基于碳的纳米酶的酶活性已成为一个关键的研究重点。

金属由于其多价性和高自旋特性，在调节电子环境以满足电子转移需求方面非常有效[27]。金属掺杂对纳米酶有多种优势。例如，Fe掺杂可以诱导结构重构并产生大量的替代缺陷，协同增强纳米酶的催化活性和底物结合能力。它还促进能带结构重组，产生局域化的电子，从而在NIR区域产生明显的表面等离子体共振效应，使纳米酶能够模拟酶级联反应，破坏肿瘤细胞中的氧化还原和代谢平衡，显著提高治疗效果。此外，金属组分的强等离子体效应与PTT或PDT剂协同作用，进一步增强了治疗效果。金属离子的配位作用使得近红外光能够深入穿透，从而提高组织穿透深度，并刺激纳米颗粒产生更强的热效应和活性氧（ROS）。此外，增强的比表面积与金属-碳之间的协同作用显著增加了纳米酶中催化活性位点的密度。例如，高等人通过热解法合成了Cu/C纳米酶，其过氧化物酶模拟活性比Cu²⁺/C纳米酶高10倍[28]。与其它过渡金属掺杂剂（Mn [29]、Zn [30]、Mo [31]、Cu [32]、Co [33]、W [34]）相比，Fe掺杂的碳纳米酶表现出更强的POD样活性，其活性位点利用度的提高被认为是潜在机制[35]。同时，氧化还原活性金属离子通过消耗GSH调节肿瘤微环境，从而提高氧化应激水平。

DOX/FeNHC-PEG纳米平台被设计用于协调三重组合疗法，整合了化疗、PTT和ROS生成，并具有pH/NIR响应特性。该系统的核心是Fe/N共掺杂的空心碳纳米酶，它既作为光热剂，又作为ROS生成的催化剂[36]。通过局部高温和ROS风暴实现了肿瘤微环境的重塑，实时剪切波弹性成像显示细胞外基质沉积显著减少。这种肿瘤硬度的降低增强了药物渗透性并促进了化学敏感性，从而更有效地消除了深部肿瘤细胞。组织病理学分析进一步显示，在NIR照射下用DOX/FeNHC-PEG处理的肿瘤中出现了广泛的坏死区域。最终的治疗评估确认了95.8% ± 1.8%的肿瘤抑制率，这主要归因于化疗-光热协同作用产生的增强氧化应激。

材料

化学试剂来自以下供应商：多巴胺盐酸盐和1,3,5-三甲基苯（TMB）来自Aladdin Reagent（中国上海）；Pluronic F127来自Sigma Chemical Co.（美国密苏里州圣路易斯）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）来自上海Macklin Biochemical Co.；2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）来自Melonepharma Biotechnology（中国大连）；Calcein-AM/PI来自Beyotime（中国上海）。

FeNHC合成的优化

纳米颗粒采用硬模板法制备（图1A）。首先，通过St?ber方法制备SiO?纳米颗粒。然后使用这些SiO?纳米颗粒作为模板，在其表面通过多巴胺吸附和自聚形成均匀的多巴胺（PDA）层，得到SiO?@PDA纳米颗粒。先前的研究表明，Fe³⁺可以与多巴胺（DA）螯合，从而改变参与碳载体酶活性的活性位点

结论

本文开发了一种TME氧化应激放大剂（FeNHC），它能够通过消耗内源性GSH和增强ROS来重塑细胞内的氧化还原平衡。在被肿瘤细胞摄取后，FeNHC-PEG纳米酶由于其显著的OXD样和POD样酶活性，导致肿瘤内GSH耗尽和ROS增加，从而引起TME氧化损伤，并进一步增强凋亡效应

CRediT作者贡献声明

程辉：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿创作，概念构思。余彤：撰写 – 审稿与编辑，验证。王艳红：撰写 – 审稿与编辑。赵阳：监督，项目管理，资金获取。赵勤富：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取。冯慧芬：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

非常感谢郑州大学第五附属医院“研究启动基金”和辽宁省“星燎人才计划”（编号：XLYC2203156）的资助。