《Advanced Science》：Irgm1 Improves Postinfarction Cardiac Repair by Promoting Neutrophil Clearance and Efferocytosis
编辑推荐：
这篇原创研究揭示了免疫相关GTP酶Irgm1在心肌梗死后心脏修复中的关键作用。研究发现，Irgm1通过介导PDIA3的自噬降解，激活内质网应激/NF-κB/caspase-3通路，从而促进中性粒细胞凋亡及巨噬细胞的胞葬作用，加速炎症消退。靶向PDIA3的抑制剂LOC14展现出改善Irgm1缺失小鼠心脏功能的治疗潜力，为心肌梗死后心力衰竭的治疗提供了新靶点。
引言
心肌梗死后的延迟炎症消退是导致不良心脏重塑和心力衰竭的关键因素。中性粒细胞作为最先浸润梗死心肌的免疫细胞，其及时清除对于炎症的适时消退至关重要。巨噬细胞介导的、对凋亡中性粒细胞的胞葬作用是清除中性粒细胞的主要方式，但其中的具体调控机制尚不明确。免疫相关GTP酶（IRG）家族成员Irgm1（人类对应基因为IRGM）在感染和自身免疫疾病中的作用已有研究，但其在心血管疾病，特别是心肌梗死后心脏修复中的作用鲜有报道。本研究旨在探索Irgm1是否以及如何调控心肌梗死后中性粒细胞的清除和胞葬作用。
结果
2.1 中性粒细胞IRGM/Irgm1上调与改善的心肌梗死预后相关
研究人员发现，心肌梗死患者外周血中性粒细胞中的IRGM表达显著升高，且其表达水平与更好的预后指标（如较低的NT-proBNP、cTnI、CK-MB、CRP、IL-6、IL-1β水平）呈负相关。在心肌梗死小鼠模型中，心脏浸润的中性粒细胞及外周血中性粒细胞中的Irgm1蛋白水平也显著上调。生物信息学分析和免疫荧光染色进一步证实，Irgm1在梗死心脏中主要与中性粒细胞标志物Ly6G、MPO和NE共定位，提示Irgm1在中性粒细胞中特异性表达，并与心肌梗死后心脏损伤减轻及预后改善密切相关。
2.2 中性粒细胞特异性Irgm1缺失加重心肌损伤和心脏功能障碍
为了探究Irgm1的功能，研究团队构建了中性粒细胞特异性Irgm1敲除小鼠。与野生型小鼠相比，Irgm1敲除小鼠在心肌梗死后28天的存活率更低，血清肌钙蛋白水平更高，表明心肌损伤更严重。超声心动图评估显示，敲除小鼠的左心室射血分数和缩短分数显著降低，而左心室内径和舒张末期容积增大，提示心室扩张和功能恶化更严重。TTC染色和Masson三色染色进一步证实，Irgm1敲除小鼠在梗死第3天和第28天分别表现出更大的梗死面积和纤维化瘢痕面积。这些结果表明，中性粒细胞Irgm1缺失会加剧心肌梗死后的心脏功能障碍、促进不良重塑和纤维化。
2.3 中性粒细胞特异性敲除Irgm1抑制心肌梗死后心脏修复
研究进一步评估了修复过程。TUNEL染色显示，Irgm1敲除小鼠在梗死边缘区的心肌细胞凋亡更为严重。在修复期（梗死后第7天），敲除小鼠梗死区胶原III表达减少，而促纤维化的肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白表达增加，同时微血管密度降低。促纤维化基因（Col3a1, Col1a1, α-SMA）表达上调，而修复型巨噬细胞标志物Arginase 1表达下调。这些数据表明，Irgm1缺失损害了血管新生，加剧了细胞凋亡和纤维化，不利于组织修复。
在炎症消退方面，H&E和免疫组化染色发现，Irgm1敲除小鼠在梗死后第3天，心脏梗死区及边缘区有更密集的炎症细胞浸润，特别是Ly6G+中性粒细胞数量显著增加。虽然巨噬细胞数量无差异，但细胞因子检测显示，敲除小鼠血浆中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6水平升高，而抗炎因子IL-10水平降低。心脏组织中促炎基因表达上调，抗炎基因表达下调，且修复型Arg-1+巨噬细胞减少。这些结果表明Irgm1缺失延迟了心肌梗死后的炎症消退。
2.4 中性粒细胞特异性Irgm1缺失延迟心脏浸润中性粒细胞的清除
为探究中性粒细胞增多的原因，研究团队通过流式细胞术分析了中性粒细胞在心脏、血液和骨髓中的动态变化。结果显示，在梗死早期（24小时），两组小鼠心脏中的中性粒细胞数量无差异；但在48小时、72小时和7天时，Irgm1敲除小鼠心脏中的中性粒细胞数量显著高于野生型小鼠。而在血液和骨髓中，两组的中性粒细胞数量在所有时间点均无显著差异。这表明Irgm1缺失并不影响中性粒细胞的生成、动员或早期招募，而是损害了其在心脏组织中的后期清除。
功能实验表明，Irgm1缺失不影响中性粒细胞表面粘附分子LFA-1和Mac-1的表达，也不影响其与内皮细胞的粘附能力。然而，免疫荧光染色显示，敲除小鼠心脏中巨噬细胞对中性粒细胞的胞葬作用显著减弱。体外共培养实验进一步证实，与野生型中性粒细胞共培养时，骨髓来源巨噬细胞的胞葬作用更强，且表现出更高的抗炎表型（Arg-1和IL-10表达升高）；而与Irgm1敲除中性粒细胞共培养时，巨噬细胞的胞葬作用和抗炎表型均受损。补充重组Irgm1蛋白可以部分恢复这种缺陷。
2.5 中性粒细胞特异性Irgm1缺失通过caspase-3通路延迟中性粒细胞清除
中性粒细胞清除的主要途径是凋亡后的胞葬作用。研究发现，Irgm1敲除小鼠心脏中的中性粒细胞凋亡减少，流式细胞术检测显示早期凋亡标志物磷脂酰丝氨酸暴露减少。体内过继转移实验直接证明，注射到心肌梗死野生型小鼠体内的Irgm1敲除中性粒细胞，其存活数量显著高于野生型中性粒细胞，表明Irgm1缺失延长了中性粒细胞的体内存活时间。
体外实验中，使用特异性结合早期磷脂酰丝氨酸的乳粘蛋白进行染色，发现经LPS刺激后，野生型中性粒细胞出现明显的磷脂酰丝氨酸暴露，而Irgm1敲除中性粒细胞则显著减少。碘化丙啶共染色显示，敲除组中有更多细胞处于碘化丙啶阳性但无磷脂酰丝氨酸暴露的状态（即晚期凋亡/坏死），而健康细胞比例更高。台盼蓝染色计数也证实，敲除组中健康中性粒细胞的绝对数量更多，死亡细胞更少。机制上，Irgm1缺失导致cleaved caspase-3蛋白水平显著降低。使用caspase-3激活剂Raptinal处理可以部分恢复Irgm1敲除中性粒细胞的磷脂酰丝氨酸暴露和胞葬作用；而使用抑制剂Z-DEVD-FMK则会抑制野生型中性粒细胞的这些过程。因此，Irgm1通过调控caspase-3通路来促进中性粒细胞凋亡和清除。
2.6 Irgm1通过与PDIA3相互作用并诱导其降解来促进中性粒细胞清除
为了寻找Irgm1的上游作用靶点，研究进行了免疫沉淀联合质谱分析和RNA测序。质谱分析将蛋白质二硫键异构酶A3鉴定为Irgm1的潜在相互作用蛋白。RNA测序和q-PCR显示PDIA3的mRNA水平无变化，但其蛋白水平在Irgm1敲除中性粒细胞中显著升高，提示Irgm1在翻译后水平调节PDIA3。
分子对接模拟显示两者可形成稳定氢键。免疫荧光、免疫共沉淀和邻位连接技术实验均证实了Irgm1与PDIA3在细胞质内直接相互作用。在HL-60细胞（中性粒细胞样细胞系）中，敲低IRGM导致PDIA3蛋白水平升高，而过表达IRGM则降低其水平，且不影响其mRNA。环己酰亚胺实验表明，Irgm1缺失显著延长了PDIA3蛋白的半衰期。使用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1可以阻断Irgm1介导的PDIA3降解，而蛋白酶体抑制剂MG132则不能，证明该降解依赖于自噬途径而非泛素-蛋白酶体系统。进一步实验证实，Irgm1和PDIA3均与自噬接头蛋白p62相互作用，且在自噬关键蛋白ATG5缺失的情况下，IRGM无法降解PDIA3。
2.7 Irgm1-PDIA3轴通过内质网应激/NF-κB/caspase-3通路延迟中性粒细胞清除和胞葬作用
PDIA3是内质网应激的关键调节因子。透射电镜观察发现，LPS刺激后，野生型中性粒细胞的内质网发生肿胀，显示出应激形态；而Irgm1敲除中性粒细胞的内质网肿胀减轻，体积变小，内质网应激标志物GRP78的表达也降低。使用PDIA3抑制剂LOC14处理可以部分恢复敲除细胞的内质网应激水平、磷脂酰丝氨酸暴露和胞葬作用。
RNA测序的基因集富集分析表明，Irgm1缺失与NF-κB信号通路的下调显著相关。NF-κB/caspase-3是诱导凋亡的关键通路。免疫印迹显示，Irgm1敲除中性粒细胞中，内质网应激标志物（GRP78, ATF6）、磷酸化P65 (p-P65) 和cleaved caspase-3的水平均降低。在HL-60细胞中过表达IRGM则得到相反的结果。使用内质网应激抑制剂4-PBA处理，会降低GRP78、ATF6、p-P65和cleaved caspase-3的水平，并同时抑制中性粒细胞的磷脂酰丝氨酸暴露和胞葬作用。这些结果证明，Irgm1通过与PDIA3相互作用并促进其通过自噬途径降解，从而解除PDIA3对内质网应激的抑制，激活下游的NF-κB/caspase-3信号轴，最终促进中性粒细胞的凋亡和清除。
2.8 补充LOC14改善心肌梗死后心脏修复和心功能
基于上述机制，研究评估了靶向PDIA3是否具有治疗潜力。研究人员对心肌梗死后的野生型和Irgm1敲除小鼠连续7天腹腔注射PDIA3抑制剂LOC14。结果显示，LOC14处理部分恢复了敲除小鼠中性粒细胞的内质网应激水平。更重要的是，LOC14治疗显著改善了两种小鼠的心功能，提高了射血分数和缩短分数，减少了左心室扩张，缩小心肌梗死面积和纤维化瘢痕面积，并增强了心脏中的中性粒细胞胞葬作用。同时，LOC14下调了促纤维化基因的表达，上调了巨噬细胞修复表型相关基因的表达。在假手术小鼠中，LOC14处理未引起心功能或组织结构的明显变化，说明其作用具有病理状态特异性。这些发现表明，靶向Irgm1-PDIA3轴，特别是使用PDIA3抑制剂LOC14，有望成为改善心肌梗死后心脏修复，尤其是针对Irgm1功能缺失个体的潜在治疗策略。
