心肌缺血再灌注损伤新机制：血小板活化因子触发GSDMD依赖性中性粒细胞胞外诱捕网形成

《Advanced Science》：PAF Triggered Pyroptotic NETosis Aggravates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury

这篇研究揭示心肌缺血/再灌注（MI/R）损伤的关键新机制：心脏细胞释放的血小板活化因子（PAF）通过激活中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和gasdermin D（GSDMD）驱动中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成与NETosis，进而加剧心肌损伤。该研究筛选发现达格列净（Dapagliflozin）可靶向脂质运载蛋白-2（LCN2）抑制此通路，为MI/R损伤治疗提供了全新的潜在靶点。

　　

引言：心肌再灌注治疗中的关键挑战

急性心肌梗死是导致死亡的主要原因之一，而血运重建治疗（如经皮冠状动脉介入治疗PCI）是恢复缺血心肌血流的标准疗法。然而，再灌注本身会导致继发性心肌损伤，即心肌缺血/再灌注（MI/R）损伤。尽管对再灌注期间的病理生理变化已有诸多研究，但如何将这些机制整合并最终导致心肌细胞死亡的细节仍不清楚，且少有发现能成功转化为有效疗法。MI/R损伤的窗口期狭窄，一旦梗死面积形成即不可逆转。因此，识别驱动MI/R损伤早期发作的内在因素和机制至关重要。

中性粒细胞浸润是MI/R的早期事件

研究发现，在MI/R小鼠模型中，中性粒细胞（CD45⁺CD11b⁺Ly6G⁺）在再灌注后3小时即迅速浸润心肌组织，并在12小时达到高峰，而巨噬细胞则呈现相反趋势。蛋白组学分析也显示，中性粒细胞相关蛋白（如LCN2、S100A8）是MI/R后心肌组织中变化最显著的蛋白之一。使用Ly6G中和抗体特异性清除中性粒细胞，能显著减小MI/R小鼠的梗死面积、减少细胞死亡，并降低炎症因子和心肌损伤标志物水平，表明中性粒细胞浸润是MI/R的早期致病标志。

中性粒细胞通过GSDMD介导的NETs形成加剧MI/R损伤

研究证实，MI/R条件下，浸润到心肌组织的中性粒细胞会经历GSDMD依赖性NETosis，从而加重心肌损伤。在MI/R小鼠中，炎性caspase-1和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）在术后6小时即被激活，GSDMD的活化也先于凋亡执行蛋白PARP的大量激活。药理学抑制caspase-1（vx-765）或NE（sivelestat）可使小鼠对MI/R诱导的心肌梗死不敏感。此外，Gsdmd^-/-小鼠在MI/R后未表现出明显的NETs形成，但中性粒细胞浸润比例未变。将Gsdmd^-/-中性粒细胞过继转移到清除了中性粒细胞的受体小鼠体内，可显著减少NETs形成并减轻MI/R损伤。这些数据证明，清除中性粒细胞中的GSDMD足以减少NETs形成并减轻MI/R损伤。

NETosis在再灌注后6小时即发生，早于炎性细胞因子大量升高和明显的细胞死亡。体外实验表明，静息的中性粒细胞不会导致心肌细胞损伤，但被PMA预激活或分离出的NETs能直接导致心肌细胞死亡。在体内，使用NETs抑制剂DNase I或Cl-amidine hydrochloride能显著消除NETs，并有效减轻再灌注后24小时的心脏损伤。这些结果证明，NETosis在MI/R损伤发作期即出现，是促进心肌细胞死亡和加剧梗死的因果因素。

缺氧/复氧处理的心肌细胞来源的PAF驱动GSDMD依赖性NETs形成

为了探究MI/R期间NETs如何形成，研究者使用了体外缺氧/复氧（H/R）模型。来自H/R处理后心肌细胞的条件培养基（HRCM）能诱导强烈的中性粒细胞死亡和核成分挤出，形成类似PMA诱导的典型NETs。进一步分离发现，只有小分子组分（分子量 < 6 kDa）能诱导NETosis，而大分子组分无效。蛋白酶K或DNase I处理的HRCM仍能诱导NETosis，提示损伤心肌细胞分泌的代谢因子可能是激活NETosis的原因。

通过筛选包含829种化合物的内源性代谢物库，研究者发现血小板活化因子（PAF）是最有效的NETosis激活剂之一，其IC₅₀为320 nM。PAF是一种在MI/R临床过程中释放的炎症介质，与心血管疾病风险因素显著相关。机制上，PAF诱导的NETosis依赖于GSDMD，但不依赖于caspase-1或caspase-11，而是依赖于中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）。Elane^-/-（NE缺陷）中性粒细胞对PAF介导的NETosis具有抵抗力，且PAF处理下GSDMD的切割和膜定位减少。药理学抑制NE（sivelestat）能显著减少PAF诱导的NETs形成和GSDMD切割。与经典炎症小体介导的GSDMD处理不同，PAF不激活炎性caspases和IL-1β释放，但能导致网状结构形成和细胞膜破裂，以及N-GSDMD与NETs共定位。这些发现揭示了NE依赖性GSDMD切割和NETs形成参与了PAF介导的NETosis。

抑制PAF-GSDMD-NETosis信号轴可减轻MI/R损伤

在MI/R过程中，心肌组织中的PAF在再灌注后3小时的早期阶段即显著升高。PAF的合成主要通过两条途径：由PLA2和LPCAT2介导的重塑途径，以及需要CHPT1酶的从头合成途径。研究发现，参与重塑途径的关键酶Pla2g6在MI/R小鼠体内和H/R条件下的心肌细胞中均显著上调。选择性PLA2G6抑制剂S-Bromoenol lactone（S-BEL）能抑制H/R处理心肌细胞中的PAF产生，并延缓HRCM诱导的NETosis。

在体内，抑制PLA2G6（使用S-BEL）或PAF受体（使用rilapladib）均能显著减轻MI/R损伤，减少心脏PAF浓度和NETs形成。在Gsdmd^-/-小鼠中，抑制PLA2G6并未显示出进一步的保护作用，表明PAF加剧MI/R损伤在很大程度上依赖于GSDMD/NETosis通路。这些数据证明，心肌细胞来源的PAF触发的NETosis是MI/R损伤的关键诱因，而PAF在损伤心肌组织中的积累与PLA2G6的上调密切相关。

达格列净通过靶向LCN2抑制NETosis并缓解心脏损伤

为了寻找潜在的NETosis抑制剂，研究者使用PMA和PAF诱导的NETosis模型筛选了1499种FDA批准的药物库，发现SGLT2抑制剂达格列净（Dapagliflozin）表现出强大的抑制效力（约80%）。达格列净能抑制NETs形成和NETosis，并减少N-GSDMD的产生。值得注意的是，达格列净对NETosis的抑制作用不依赖于SGLT2，因为它在Slc5a2^-/-（SGLT2敲除）中性粒细胞中也显示出等效的抑制效果。其他SGLT2抑制剂（如恩格列净、卡格列净、埃格列净）也能抑制NETosis，但效果较弱。

预给药达格列净能显著减轻MI/R小鼠的心脏梗死面积、纤维化和NETosis，但不影响心脏组织中的PAF水平。其心脏保护作用也是SGLT2非依赖性的，因为它在Slc5a2^-/-小鼠中同样有效。在过继转移了Gsdmd^-/-中性粒细胞的小鼠中，达格列净无法再提供保护，表明GSDMD-NETosis信号通路是介导达格列净心脏保护活性所必需的。

为了解析达格列净抑制NETosis的潜在靶点，研究者采用了有限蛋白酶解偶联质谱（LiP-MS）方法。分析发现，达格列净特异性结合并改变了中性粒细胞来源的脂质运载蛋白-2（LCN2）的蛋白水解模式。分子对接和结构分析进一步支持了达格列净与LCN2的结合。功能实验证实，沉默LCN2会减弱达格列净对NETosis的保护作用，而过表达LCN2则可挽救此表型。表面等离子共振（SPR）分析验证了达格列净与重组人LCN2蛋白的直接相互作用，其平衡解离常数（K_D）为2.7 × 10^-7M。因此，达格列净通过直接靶向LCN2来抑制PAF诱导的NETosis，从而发挥心脏保护作用。

临床相关性验证

对72名接受PCI手术的急性心肌梗死（AMI）患者进行分析发现，术后患者血清中的NETs标志物（如cfDNA）和PAF浓度均升高。值得注意的是，其中7名长期服用达格列净的糖尿病患者，其PCI术后心脏损伤和NETosis指标显著降低。血清PAF浓度与cfDNA水平呈正相关，且cfDNA、LCN2和PAF水平与LDH、CK、CK-MB、S100A8/A9等心肌损伤标志物也呈正相关。这些临床数据进一步支持了NETosis与接受PCI手术的AMI患者不良预后相关，而长期使用达格列净可能对心肌梗死高风险患者具有治疗益处。

结论

该研究系统阐明了MI/R损伤早期免疫代谢与细胞死亡模式之间的动态相互作用。研究确定中性粒细胞浸润和NETosis是MI/R损伤的早期因果因素。心脏细胞在MI/R期间释放的PAF通过激活NE和GSDMD，驱动NETs形成和NETosis。PAF的积累与PLA2G6酶活性增强有关。更重要的是，研究发现降糖药达格列净是一种有效的NETosis抑制剂，它能通过靶向LCN2（而非SGLT2）来抑制PAF-NETosis轴，从而保护小鼠免受MI/R损伤。临床数据也支持达格列净对PCI术后心肌损伤的缓解作用与抑制NETosis相关。这项工作为MI/R损伤中的早期免疫代谢串扰提供了新的机制见解，并将PAF-NETosis轴确立为一个有前景的治疗靶点。