《Advanced Science》：NIBAN2/FLII/RREB1 Axis Drives Glioma Stem Cell Malignancy via TLR3 Pathway Activation
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本研究首次揭示了NIBAN2（FAM129B）在胶质瘤干细胞（Glioma Stem-like Cells, GSCs）中的核心作用，它通过结合FLII并促进其与转录因子RREB1的相互作用及核转位，形成NIBAN2/FLII/RREB1轴，共同激活TLR3信号通路，从而维持GSC的干性（Stemness）和致瘤性。该轴还通过RREB1转录上调NIBAN2自身及CD44，形成正反馈循环，并调控关键糖酵解酶LDHA（Lactate Dehydrogenase A）的表达，驱动代谢重编程。药物筛选发现，HIV蛋白酶抑制剂奈非那韦（nelfinavir）能特异性破坏NIBAN2-FLII复合物，与LDHA抑制剂FX11联用，在类器官和患者来源异种移植模型中展现出协同抗肿瘤效应，为靶向GSC提供了新的精准治疗策略。
NIBAN2在胶质瘤组织及GSC中高表达并与不良预后相关
为了系统鉴定维持胶质瘤干细胞（GSCs）干性的核心调控因子，研究团队收集了正常脑组织、低级别胶质瘤和高级别胶质瘤的临床样本进行分析。通过蛋白芯片分析发现，NIBAN2（又称FAM129B）在胶质瘤组织中显著高表达，且表达水平与肿瘤级别呈正相关。蛋白质印迹、定量PCR和免疫组织化学染色结果一致显示，与正常脑组织相比，NIBAN2在胶质瘤组织中上调。从患者样本中建立的八株原代胶质母细胞瘤细胞系及其诱导的GSCs分析表明，与亲本细胞相比，GSCs中NIBAN2表达普遍增高。对TCGA数据库的分析进一步证实，NIBAN2在胶质瘤组织中高表达，并且其高表达与患者的不良预后显著相关，提示NIBAN2可能是胶质瘤进展和GSC维持的关键调控因子。
NIBAN2促进胶质瘤干细胞的恶性表型
研究团队通过一系列体外和体内功能实验证实了NIBAN2对GSC恶性表型的促进作用。在肿瘤球形成实验中，过表达NIBAN2显著增强了GSC在无血清、低黏附条件下的成球能力，所形成的肿瘤球数量更多、体积更大。极限稀释实验分析显示，过表达NIBAN2显著提高了干细胞频率。软琼脂集落形成实验也表明，NIBAN2增强了GSC的锚定非依赖性生长能力。蛋白质印迹分析显示，过表达NIBAN2上调了CD133、CD44、NANOG和Nestin等经典的干性标志物表达。在体内，将过表达NIBAN2的GSC原位注射到免疫缺陷小鼠颅内后，小鼠生存期显著缩短，肿瘤发生率更高，体积更大，且肿瘤组织中SOX2和Ki-67表达上调。相反，敲低NIBAN2则导致上述恶性表型减弱。这些结果共同表明，NIBAN2是GSC维持干样表型和恶性功能状态的关键正向调控因子。
NIBAN2与FLII相互作用并促进其核转位
为阐明NIBAN2调控GSC干性的分子机制，研究者进行了免疫共沉淀偶联质谱分析，并鉴定出Flightless I（FLII）是NIBAN2的关键结合蛋白。随后的免疫共沉淀实验证实了NIBAN2与内源性FLII在GSCs中存在相互作用。GST pull-down实验进一步验证了NIBAN2与FLII在体外能够直接结合。通过免疫荧光和核质分离实验发现，在对照GSC中，FLII主要定位于细胞质；而过表达NIBAN2则显著促进了FLII的核转位，使其与NIBAN2在核内强烈共定位。相反，敲低NIBAN2则损害了FLII的核定位，使其滞留在细胞质中。这表明NIBAN2不仅与FLII形成稳定复合物，还促进了其从细胞质到细胞核的转位，这可能有助于其介导的GSC干性维持。
NIBAN2通过FLII促进胶质瘤干细胞的恶性表型
为了验证NIBAN2介导的GSC干性和恶性表现是否依赖于FLII，研究者在过表达NIBAN2的背景下敲低了FLII。功能拯救实验显示，FLII敲低显著减弱了由NIBAN2过表达引起的肿瘤球形成能力增强、干细胞频率升高以及软琼脂集落形成能力增强。蛋白质印迹分析也表明，FLII敲低抑制了NIBAN2诱导的CD44、CD133、NANOG和Nestin等干性标志物的上调。在体内，过表达NIBAN2显著缩短了小鼠的生存期，而同时敲低FLII则能显著延长生存期，几乎恢复到对照组水平，并且肿瘤体积和侵袭性也得到抑制。组织学分析显示，FLII敲低显著下调了肿瘤组织中SOX2和Ki-67的表达。这些数据证明，NIBAN2显著增强了GSC在体内的致瘤性，而FLII敲低可以部分或完全逆转这种效应，表明FLII是NIBAN2致癌功能的关键下游效应器。
NIBAN2促进FLII-RREB1复合物形成并增强其核内相互作用以调控干性程序
进一步的蛋白质组学分析表明，在NIBAN2免疫复合物中，转录因子RREB1在FLII富集时被高度共富集。免疫共沉淀实验发现，NIBAN2过表达能以剂量依赖的方式显著增强FLII与RREB1的结合，而NIBAN2敲低则导致该复合物形成减少。三元免疫共沉淀实验表明NIBAN2可以同时结合FLII和RREB1，起到桥梁稳定作用。免疫荧光共染色显示，在过表达NIBAN2的GSC中，FLII与RREB1的核内共定位显著增加。邻近连接实验进一步证实，NIBAN2过表达显著增加了FLII与RREB1在核内的相互作用信号。这些发现支持了NIBAN2通过促进FLII核转位并增强其与RREB1在核内的空间相互作用来调控GSC干性程序的机制。
敲低RREB1减弱NIBAN2诱导的胶质瘤干细胞恶性表型
为确定RREB1是否是NIBAN2驱动的恶性表型的关键下游效应器，研究者在NIBAN2过表达的背景下敲低了RREB1。功能拮抗实验显示，RREB1敲低显著削弱了GSC的肿瘤球形成能力、干细胞频率和软琼脂克隆形成能力。蛋白质印迹分析证实，RREB1敲低逆转了NIBAN2诱导的干性标志物（CD44、CD133、NANOG、Nestin）上调。在体内，与对照组相比，过表达NIBAN2显著缩短了小鼠的中位生存期，而同时敲低RREB1则显著延长了生存期，肿瘤体积和恶性特征也得到抑制。这些结果表明，RREB1不仅是NIBAN2介导的GSC干性表型的关键共调节因子，也是其体内驱动的胶质瘤进展所必需的下游效应器。
RREB1通过转录激活NIBAN2和CD44来维持GSC干性
研究发现，RREB1直接结合到NIBAN2和CD44启动子区的Ras反应元件上。染色质免疫沉淀-定量PCR分析显示RREB1在这些位点的结合富集。RT-qPCR和蛋白质印迹分析表明，敲低RREB1下调了NIBAN2和CD44的表达，而过表达RREB1则上调了它们的表达。通过JASPAR数据库预测并结合双荧光素酶报告基因实验验证，RREB1能显著增强NIBAN2和CD44启动子的转录活性，而突变预测的结合位点则消除了这种激活。功能上，RREB1过表达促进了肿瘤球形成，而敲低NIBAN2或CD44则部分逆转了这种干性促进作用。这表明RREB1通过直接转录激活NIBAN2和CD44来驱动GSC的干性程序。
RREB1通过转录调控LDHA驱动有氧糖酵解并维持GSC的代谢干性
RNA测序分析显示，敲低RREB1导致糖酵解相关基因整体下调，其中LDHA下调最为显著。京都基因与基因组百科全书通路富集分析和基因集富集分析均证实糖酵解是受RREB1调控的关键通路。海马能量代谢分析表明，RREB1敲低显著降低了GSC的基础糖酵解速率和补偿糖酵解能力。靶向代谢组学分析也显示，RREB1敲低的细胞中葡萄糖-1-磷酸、果糖-6-磷酸、3-磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸等关键糖酵解中间体显著减少。进一步的机制研究表明，RREB1直接结合到LDHA启动子区的RREs上，并能转录上调LDHA的mRNA和蛋白水平。双荧光素酶报告实验证实，RREB1能激活LDHA启动子，而突变结合位点则削弱了此激活作用。综上，RREB1通过直接转录激活LDHA，促进有氧糖酵解通量，从而维持GSC的代谢稳态和干性。
NIBAN2/FLII/RREB1轴在临床胶质瘤样本中协同表达并与不良预后显著相关
对118例不同级别胶质瘤临床样本的分析显示，NIBAN2、FLII和RREB1在胶质母细胞瘤组织中表达一致上调，显著高于低级别胶质瘤和正常脑组织。多重免疫荧光成像证实了这三者在GBM样本中的共表达。分层统计分析显示，三者高表达的频率随肿瘤级别升高而增加。分子亚型分析表明，该环路在MGMT启动子非甲基化和IDH野生型患者中表达更高。组织病理学检查发现，环路成分共表达的患者常伴随肿瘤坏死、血管增生增加和弥漫浸润边缘等恶性特征。Kaplan-Meier生存分析表明，三者高表达与更短的无进展生存期和总生存期显著相关，提示环路激活可作为不良预后的生物标志物。此外，双通道免疫荧光显示，NIBAN2与FLII在SOX2阳性的干细胞富集区域存在显著的核内共定位，且RREB1核表达上调，这些标志物在空间上重叠，提供了环路协调激活的组织学证据。
联合抑制NIBAN2和LDHA在NIBAN2高表达胶质瘤模型中诱导协同抗肿瘤效应
通过基于结构的虚拟筛选，研究鉴定出已获FDA批准的药物奈非那韦（nelfinavir）是NIBAN2的高亲和力结合剂。免疫共沉淀实验验证了奈非那韦能破坏NIBAN2-FLII复合物的相互作用。在来自高表达NIBAN2胶质瘤患者的类器官模型中，单独使用奈非那韦或LDHA抑制剂FX11可适度降低类器官活力，而两者联合治疗则显示出超过80%的强烈协同毒性，并伴随Caspase-3/7活性增加、凋亡细胞增多以及SOX2和Ki-67表达下降。在患者来源异种移植模型中，奈非那韦和FX11联合治疗显著抑制了肿瘤生长，将肿瘤体积减少了75%以上，并将小鼠中位生存期从22天延长至45天，且不影响小鼠体重，表明良好的耐受性。免疫荧光显示联合治疗组肿瘤中NIBAN2和LDHA表达下调，Ki-67阳性减少，TUNEL阳性细胞增多。代谢组学分析也显示联合治疗后乳酸水平降低，细胞外酸化率显著下降，表明糖酵解受到有效抑制。这些发现表明，靶向NIBAN2-FLII相互作用与抑制LDHA介导的糖酵解相结合，在NIBAN2高表达的胶质瘤模型中能产生强大的协同抗肿瘤效应，为针对胶质瘤代谢脆弱性的治疗提供了新的转化潜力。
