《Advanced Science》：Coacervate-Mediated Lysosome-Targeting Antibody Delivery for Protein Degradation
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本研究报道了一种新型的溶酶体靶向凝聚体递送系统（Lysosome-Sorting Peptide Coacervates， LSP-Coa），实现了抗体-膜蛋白复合物的跨膜转运与溶酶体靶向降解。研究人员将溶酶体靶向四肽（NPGY）改造为可发生液液相分离（LLPS）的肽段衍生物，其在溶液中自组装形成具有液体性质的微滴（凝聚体）。这些LSP-Coa能够自发性进入细胞并定位于溶酶体，高效封装蛋白质。当与特定抗体（如抗HER2的曲妥珠单抗、抗EGFR的西妥昔单抗）偶联后，该系统可将抗体-膜蛋白复合物递送至溶酶体进行降解，此机制被命名为凝聚体介导的溶酶体靶向蛋白质降解（Coacervate-mediated Lysosome-targeting Protein Degradation， CoaLPD）。研究在细胞和荷瘤小鼠模型中成功降解了HER2和EGFR，并显示出显著的抗肿瘤效果。此外，LSP-Coa还能通过增强细胞摄取来提高PROTAC分子的降解效率。这项工作为靶向降解传统上“不可成药”的膜结合蛋白提供了一种不依赖于溶酶体靶向受体（LTR）表达水平的新策略，展现出作为潜在抗癌疗法的广阔前景。
1 引言
靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation， TPD）已成为一种前景广阔的抗癌治疗策略。传统的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）技术通过小分子将靶蛋白招募至泛素-蛋白酶体系统进行降解，但对于许多膜结合的癌症相关蛋白（Cancer-Associated Proteins， CAPs）则无能为力。为了解决这一问题，溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）技术应运而生，它利用抗体特异性识别膜蛋白，并通过与细胞表面的溶酶体靶向受体（如甘露糖-6-磷酸受体）结合，将整个复合物内吞并运往溶酶体降解。然而，这类受体依赖策略的降解效率严重依赖于受体在细胞表面的表达水平，存在局限性。
另一方面，液液相分离（Liquid-Liquid Phase Separation， LLPS）及其形成的分子凝聚体（coacervates）为生物大分子的跨膜递送提供了新思路。符合“粘合剂-间隔物”（sticker-and-spacer）模型的分子可在水溶液中发生LLPS，形成微滴状凝聚体。这些凝聚体能够封装各种生物制剂（如蛋白质、抗体）并将其递送入细胞。然而，此前报道的凝聚体普遍缺乏将货物特异性导向特定细胞器（如溶酶体）的能力。
基于此，本研究旨在填补这一空白，通过合理设计，将已知的溶酶体特异性肽段改造为既能发生相分离形成凝聚体，又能保留其溶酶体分选能力的多肽，从而开发出一种集跨膜递送与溶酶体靶向于一体的新型递送系统。
2 结果与讨论
2.1 LSP-Coa的设计与合成
研究人员以溶酶体特异性四肽Asn-Pro-Gly-Tyr（NPGY）为基础，在其N端引入了柔性的亲水性聚乙二醇（PEG）接头和疏水性的二苯并环辛炔（DBCO）基团作为“粘合剂”，设计并合成了多种肽段衍生物。通过筛选，他们鉴定出两种能够在磷酸盐缓冲液（PBS）中形成微滴的肽段：LSP1（DBCO-PEG2-NPGY）和LSP2（DBCO-NPGY-PEG2-NPGY）。荧光显微镜观察显示，被尼罗红染色的微滴能够自发融合成更大的液滴。荧光漂白恢复（FRAP）实验证实，漂白区域的荧光信号能在一分钟内快速恢复至原强度的80%，表明这些微滴具有液体特性。通过FRAP动力学计算，LSP1和LSP2凝聚体的扩散系数分别约为2.84 × 10?2和 4.33 × 10?3μm2/s。细胞毒性实验显示，LSP2在1 mg/mL浓度下对SK-BR-3细胞无显著毒性，因此被选用于后续研究，并将其形成的凝聚体命名为溶酶体分选肽凝聚体（Lysosome-Sorting Peptide Coacervates， LSP-Coa）。进一步的表征表明，LSP-Coa在PBS和含10%胎牛血清的培养基中均能保持数小时的稳定性。
2.2 细胞摄取与溶酶体靶向
研究首先证明了LSP-Coa能够高效封装多种荧光蛋白（封装效率>60%）。随后，他们探究了LSP-Coa能否将蛋白质货物递送入细胞并特异性靶向溶酶体。实验比较了两种形式的蛋白质：未经修饰的天然蛋白和与LSP肽共价偶联的蛋白（如BSA-LSP、GFP-LSP）。共聚焦显微镜观察显示，用FAM标记的LSP2凝聚体能够自发进入SK-BR-3细胞，并与溶酶体特异性染料LysoTracker的信号共定位，证实了LSP-Coa自身的溶酶体靶向特性。当使用LSP-Coa递送Alexa Fluor 488标记的牛血清白蛋白（BSA-AF488）或绿色荧光蛋白（GFP）时，部分蛋白质信号与溶酶体信号重叠。而当递送与LSP共价偶联的蛋白质（BSA-LSP-AF488或GFP-LSP）时，货物蛋白与溶酶体的共定位信号显著增强，皮尔逊相关系数更高，表明LSP共价修饰能有效增强溶酶体靶向效率。进一步的机制研究表明，LSP-Coa的细胞摄取可能涉及多种途径，其中巨胞饮作用可能扮演了重要角色。
2.3 LSP-Coa介导的表皮生长因子受体降解
接下来，研究团队将LSP-Coa系统应用于降解人表皮生长因子受体2（HER2）。他们将抗HER2抗体曲妥珠单抗（Trastuzumab， Tras）与LSP肽通过点击化学反应偶联，形成Tras-LSP偶联物，然后将其与LSP肽混合形成含有Tras-LSP的凝聚体（Tras-LSP/LSP-Coa）。将这种凝聚体与SK-BR-3细胞共孵育后，Western blot分析显示HER2蛋白水平显著降低，且Tras-LSP/LSP-Coa的处理比仅封装未偶联Tras的凝聚体（Tras/LSP-Coa）具有更高的降解效率。这一全新的蛋白质降解方法被命名为凝聚体介导的溶酶体靶向蛋白质降解（Coacervate-mediated Lysosome-targeting Protein Degradation， CoaLPD）。
为了验证CoaLPD的靶点特异性，研究人员使用抗EGFR抗体西妥昔单抗（Cetuximab， Ctx）构建了Ctx-LSP偶联物及相应的Ctx-LSP/LSP-Coa。实验结果表明，Tras-LSP/LSP-Coa能特异性降解HER2而对EGFR无影响，反之，Ctx-LSP/LSP-Coa能特异性降解EGFR而不影响HER2，证明了该策略具有高度的选择性。
2.4 两种癌症相关蛋白的同时敲低
研究进一步证明CoaLPD策略可用于同时降解两种CAPs（如HER2和EGFR）。他们尝试了两种方法：一是将Tras-LSP和Ctx-LSP与LSP肽预先混合，形成同时封装两种抗体的单一凝聚体（Tras-LSP/Ctx-LSP/LSP-Coa）；二是分别制备Tras-LSP/LSP-Coa和Ctx-LSP/LSP-Coa，然后将两者混合后加入细胞。Western blot结果显示，两种策略均能成功实现HER2和EGFR的同时降解。细胞增殖实验表明，同时使用Tras-LSP/LSP-Coa和Ctx-LSP/LSP-Coa处理细胞，对癌细胞增殖的抑制效果显著优于使用单一抗体凝聚体，这为克服潜在的耐药性问题提供了可能。
2.5 溶酶体降解途径
为了阐明CoaLPD的降解机制，研究人员使用了蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂巴弗洛霉素（bafilomycin）进行干扰实验。结果显示，巴弗洛霉素能显著阻断Tras-LSP/LSP-Coa和Ctx-LSP/LSP-Coa介导的HER2和EGFR降解，而MG132则没有此效果。这与共聚焦显微镜下观察到的荧光标记抗体与溶酶体的共定位现象一致，证实了CoaLPD主要通过溶酶体途径而非泛素-蛋白酶体途径实现靶蛋白降解。
2.6 LSP-Coa增强PROTAC的降解效率
研究还探索了LSP-Coa作为通用递送载体，增强其他类型降解剂（如PROTAC）效力的潜力。他们以BRD4降解剂（BRD4 Degrader-5）为代表，将其与LSP-Coa共孵育后处理SK-BR-3细胞。Western blot分析表明，与单独使用PROTAC相比，联合使用LSP-Coa能显著增强对BRD4长形式和短形式的降解效果。机制研究表明，LSP-Coa可能通过增强PROTAC的细胞摄取来提高其效率，但并不改变其依赖的泛素-蛋白酶体降解途径。荧光追踪实验显示，PROTAC分子先被LSP-Coa递送至溶酶体，随后可能逃逸至细胞质并进入细胞核发挥作用。
2.7 CoaLPD在体内的抗癌效果
最后，研究在荷瘤小鼠模型中评估了CoaLPD的抗肿瘤潜力。他们在SK-BR-3细胞建立的乳腺癌小鼠模型中，瘤内注射Tras-LSP/LSP-Coa。结果显示，与PBS、LSP-Coa或单独Tras处理组相比，Tras-LSP/LSP-Coa治疗组的小鼠肿瘤生长受到了最显著的抑制，肿瘤体积和重量均显著减小，且未引起明显的体重变化。对肿瘤组织的分析显示，该治疗组出现了大量的细胞坏死，且HER2蛋白水平最低，证明了Tras-LSP/LSP-Coa通过降解HER2在体内有效抑制了肿瘤生长。
4 结论
本研究成功地将一个溶酶体特异性四肽改造为能够发生液液相分离、形成具有溶酶体靶向功能的肽段凝聚体（LSP-Coa）。该系统与LSP偶联的抗体联用，实现了一种不依赖于溶酶体靶向受体表达的高效、特异性膜蛋白降解新策略，即CoaLPD。该策略在细胞水平上展现了选择性、高效性和多功能性（如同时降解多个靶点），并在动物模型中显示出显著的抗肿瘤效果。此外，LSP-Coa还能作为通用递送平台，增强如PROTAC等其他降解剂的效力。这项工作不仅为靶向降解膜结合蛋白这一挑战提供了创新性解决方案，也为基于相分离和凝聚体的智能药物递送系统开发开辟了新道路，具有作为潜在抗癌疗法的重大意义。
