《Advanced Science》：An Implantable Scaffold Sequentially Releasing STING Agonist and B7-H3 Antibody for Bone Metastasis Immunotherapy
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本综述（研究文章）提出了一种创新的局部免疫疗法：一种由甲基丙烯酰化明胶(GelMA)制备的可植入支架，共载有STING激动剂MSA-2和包裹B7-H3抗体的碳酸钙(CaCO3)微粒。该支架旨在解决骨转移这一免疫抑制微环境对免疫检查点阻断(ICB)治疗反应不佳的难题。其设计核心是顺序释放机制，即先释放MSA-2激活STING-IFNβ通路并募集效应T细胞，随后在酸性肿瘤微环境(TME)中释放B7-H3抗体以阻断因STING活化而上调的B7-H3检查点，从而逆转T细胞耗竭。该策略在多种骨转移模型中被证实能有效重塑肿瘤免疫微环境，防止术后复发，并建立持久的免疫记忆。
引言：骨转移的临床挑战与免疫治疗瓶颈
骨是继肺和肝之后第三常见的肿瘤转移部位，骨转移患者的中位生存期仅有1-3年，预后极差。目前的标准治疗，包括双膦酸盐等骨靶向治疗联合激素或化疗，临床效果有限。免疫检查点阻断(ICB)疗法虽然在多种恶性肿瘤中取得了革命性进展，但在骨转移治疗中效果不佳。这一矛盾归因于骨髓的免疫双重性：它不仅是效应淋巴细胞的“家园”，也富含髓源性抑制细胞(MDSCs)等免疫抑制细胞，形成了环绕肿瘤的“免疫屏障”，阻碍了细胞毒性T细胞和自然杀伤(NK)细胞的浸润，导致骨转移通常被视为“冷肿瘤”。
核心策略：STING激活与B7-H3阻断的协同作用
激活干扰素基因刺激因子(STING)通路被认为是将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤的一种策略。STING激动剂可以触发I型干扰素（尤其是IFNβ）的产生，激活抗原呈递树突状细胞(DCs)，重编程免疫抑制性巨噬细胞，限制MDSCs的积累，并促进CD8+T细胞和NK细胞的募集与活化。然而，传统的环二核苷酸(STING)激动剂存在生物利用度差、易被酶降解等问题。本文采用的MSA-2是一种创新的非核苷酸小分子STING激动剂，在酸性肿瘤微环境中更易被细胞摄取。但MSA-2半衰期短，且据报道会上调肿瘤微环境中的免疫检查点分子，可能引起适应性免疫抵抗。
B7-H3（CD276）作为B7共调节分子超家族的一员，在前列腺癌等易发生骨转移的肿瘤中高表达，而在正常组织中表达极低，这使其成为一个有吸引力的免疫检查点靶点。B7-H3阻断可以增强CD8+T细胞的功能。将STING激动剂与ICB联合使用已显示出协同效应，但系统性给药STING激动剂或ICB存在免疫相关不良事件风险，且由于骨组织独特的血管分布，药物在骨髓中的浓度常达不到治疗水平。局部给药为解决这些挑战提供了极具前景的方案。
支架设计与表征：实现顺序释放的智能载体
研究人员开发了一种可植入的双药储库。他们采用受控沉淀法制备了包裹B7-H3抗体的碳酸钙(CaCO3)微粒(αB7-H3-MPs)，平均水合动力学直径约为2.92 μm，zeta电位为-9.22 mV，抗体负载量约为2.48% (w/w)。随后，将αB7-H3-MPs与STING激动剂MSA-2共同嵌入生物相容性良好的GelMA水凝胶基质中，经紫外光交联和冻干，最终形成多孔支架，最大抗压强度为19.00 N，压缩模量为5.47 MPa。
关键的是，该支架实现了pH响应的顺序释放。在模拟生理环境的中性pH 7.4条件下，72小时内仅释放了约28%的αB7-H3；而在模拟肿瘤微环境的酸性pH 6.5条件下，同期释放了约70%。相反，MSA-2的释放是pH非依赖性的，在两种pH下的释放曲线几乎重叠。因此，MSA-2会先被释放，随后在酸性肿瘤微环境中，CaCO3微粒逐渐溶解，实现αB7-H3的后续释放。体内荧光成像证实，负载了BSA-FITC-MPs和DiL（分别模拟αB7-H3和MSA-2）的支架能在植入部位维持至少14天的强荧光信号，而游离药物则在7天内迅速清除，证明了支架的持续局部药物释放能力。
体外机制验证：从通路激活到免疫细胞重编程
体外实验深入阐明了该支架的作用机制。研究首先考察了支架释放的药物对免疫抑制性细胞的调节作用。用支架释放的条件培养基处理MDSCs和骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)发现，特别是来自双载药支架的培养基，能显著降低MDSCs中免疫抑制酶精氨酸酶1(Arg1)和一氧化氮合酶(Nos2)的mRNA水平，同时显著增加干扰素β1(Ifnb1)的表达。Western blot分析证实，MSA-2处理显著上调了MDSCs和BMDMs中磷酸化STING(p-STING)及其下游磷酸化干扰素调节因子3(p-IRF3)的水平，表明STING通路被成功激活。
然而，MSA-2处理也诱导了MDSCs、BMDMs以及肿瘤细胞（如骨转移性前列腺癌细胞系Myc-Cap）中B7-H3蛋白的表达上调，这与先前报道一致，表明STING活化可能伴随检查点分子的上调，从而限制疗效。功能实验显示，经MSA-2预处理的MDSCs对CD8+T细胞增殖的抑制能力被部分解除，而经双药支架条件培养基预处理的MDSCs，其抑制效应几乎被完全消除，CD8+T细胞增殖得以近乎完全恢复。同样，MSA-2处理能驱动巨噬细胞从M2样（免疫抑制）表型向M1样（促炎、杀伤肿瘤）表型极化，而αB7-H3的加入进一步增强了这种极化。
在模拟肿瘤微环境的Myc-Cap细胞、MDSCs和BMDMs共培养体系中，MSA-2处理显著上调了三种细胞表面的B7-H3表达。当加入CD8+T细胞后，MSA-2预处理的肿瘤细胞凋亡率显著高于未处理对照组，而αB7-H3的共存进一步增强了肿瘤细胞凋亡。T细胞增殖实验也证实，仅用MSA-2预处理部分恢复了T细胞增殖，而用双药支架条件培养基预处理几乎完全逆转了T细胞增殖抑制，CD8+T细胞大量增殖。+ T细胞增殖情况。">
这些结果表明，MSA-2能有效激活STING通路，将免疫抑制的肿瘤微环境转变为“热”状态，但同时会上调B7-H3；而B7-H3阻断则能解除由此产生的免疫抑制，两者协同显著增强CD8+T细胞的增殖和细胞毒功能，导致更强的肿瘤细胞杀伤。
体内疗效验证：在骨转移前列腺癌模型中重塑免疫微环境并抑制复发
研究人员在FVB小鼠中建立了骨转移性前列腺癌(bmPCa)模型，模拟手术切除（切除约90%肿瘤）后植入支架的治疗场景。在术后第5天，通过质谱流式细胞术(CyTOF)分析肿瘤浸润免疫细胞发现，与对照组相比，支架治疗组小鼠骨髓肿瘤微环境中的免疫细胞景观发生了显著改变。特别值得注意的是，治疗组中与免疫抑制相关的CD14+MDSCs亚群比例和CD14表达水平均降低。同时，巨噬细胞向M1表型极化增加，M2表型减少，M1/M2比值显著升高。效应细胞方面，治疗组肿瘤中的CD8+T细胞表达更高水平的IFNγ、TNFα和颗粒酶B(GzmB)，表明其细胞毒性功能增强。此外，NK细胞中GzmB、TNFα和IFNγ的表达也有升高趋势，树突状细胞(DCs)上调了共刺激成熟标志物CD86，而调节性T细胞(Treg)的比例则显著降低。这些数据表明，支架治疗迅速将骨髓肿瘤微环境从免疫抑制状态重塑为免疫激活状态。+ T细胞功能分子的变化。">
在长期疗效实验中，小鼠被分为七组进行对比。结果显示，仅手术的对照组和空白支架组肿瘤迅速复发。单次注射游离MSA-2和αB7-H3仅能轻微延缓肿瘤生长。而采用顺序释放设计的双药支架(G7：scaffoldMSA-2αB7-H3-MP)疗效最佳，在21天观察期内几乎完全抑制了肿瘤生长，肿瘤抑制率接近100%，且所有小鼠在60天观察期内均存活。相比之下，释放顺序相反的支架(G6：scaffold αB7-H3MSA-2-MP)疗效则显著降低（抑制率为93.3%），凸显了顺序释放策略的重要性。微型计算机断层扫描(Micro-CT)显示，G7组小鼠胫骨保持了更正常的骨结构，骨表面更光滑。组织学分析进一步证实，G7组仅残留微小肿瘤，肿瘤细胞增殖标志物Ki67阳性细胞极少，而凋亡细胞(TUNEL+)比例最高。
持久免疫记忆与多模型验证
为了评估支架治疗能否诱导长效免疫保护，研究人员对经支架治疗获得完全缓解的小鼠进行了肿瘤再攻击实验。将Myc-Cap细胞注射到对侧（未经治疗的）胫骨中。结果显示，预先接受支架治疗的小鼠对再攻击表现出强大的抵抗力，其肿瘤生长信号远低于初次接种的对照小鼠，所有治疗组小鼠均在观察期内存活。机制分析发现，这些小鼠的脾脏中记忆T细胞（包括中央记忆T细胞TCM和效应记忆T细胞TEM）比例显著升高，成熟的DCs（CD80+CD86+）和MHCII+DCs的比例也更高，表明产生了系统性的免疫记忆。
研究进一步在4T1（乳腺癌）和LLC（肺癌）骨转移模型中验证了支架的普适性。在这两种同样高表达B7-H3的模型中，scaffoldMSA-2αB7-H3-MP均表现出卓越的治疗效果，显著抑制了肿瘤复发和进展，保护了骨骼结构，减少了肿瘤负荷。
讨论与结论
本研究针对骨转移免疫抑制微环境和现有ICB疗法疗效有限的挑战，设计了一种创新的局部免疫治疗策略。骨髓作为关键的免疫器官，其微环境中富含MDSCs和肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)，使得骨转移成为典型的“冷肿瘤”。激活STING通路是将其转化为“热肿瘤”的关键，但STING的全身性激活可能引发毒性，且单次给药难以维持持久免疫反应。本工作设计的GelMA支架实现了STING激动剂MSA-2的局部、缓释递送，在确保安全性的同时，有效激活了STING-IFNβ信号。
值得注意的是，研究发现STING激活会同时上调B7-H3这一免疫检查点分子，这可能是限制STING激动剂疗效的一个机制。因此，将STING激活与B7-H3阻断相结合具有强力的协同理论依据。本研究的关键创新在于采用了顺序释放策略：先释放MSA-2激活免疫应答并上调B7-H3，随后在酸性肿瘤微环境中释放αB7-H3抗体以阻断该检查点，防止T细胞耗竭。实验数据，特别是反向顺序释放对照组疗效较差的结果，有力证明了这种时序设计的重要性。
综上所述，本研究成功开发了一种可植入的、顺序释放STING激动剂MSA-2和B7-H3抗体的GelMA支架。该支架通过在术后肿瘤切除部位提供局部、持续的免疫调节药物释放，有效重编程了骨转移的免疫抑制微环境，减少了免疫抑制细胞（如MDSCs和M2巨噬细胞），增强了效应免疫细胞（如M1巨噬细胞、细胞毒性T细胞、NK细胞）的功能，从而在多种骨转移模型中实现了强大的肿瘤抑制、防止术后复发并诱导了持久的保护性免疫。这一策略为治疗骨转移提供了一种有前景且易于转化的局部免疫治疗新方法。
