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有机肥类型对土壤-蔬菜系统抗生素耐药基因（ARGs）分布的影响及驱动机制研究。通过 pots 实验结合高通量测序技术，揭示 ARGs 在土壤、根系和叶片中的空间分布特征，发现动物粪便肥显著增加根系 ARGs 总量及高风险ARG比例，而生物有机肥（含Bacillus和Trichoderma）通过调控微生物互作影响植物组织 ARGs积累。研究证实细菌-真菌互作、可移动遗传元件（MGEs）及土壤理化性质（pH、有机碳、氮含量）是驱动ARGs分布的关键因素，为有机肥应用中的耐药基因风险防控提供理论依据。
Jie Wu|Muqing Zhou|Jingran Zheng|Sujin Feng|Zhaoqiang Han|Jinyang Wang|Jianwen Zou
中国农业农村部东南农业绿色低碳重点实验室，南京农业大学资源与环境科学学院，江苏南京210095
摘要
抗生素抗性基因（ARGs）在农业土壤中的持续积累，主要归因于有机肥的广泛使用，对人类健康构成了重大威胁。研究不同施肥制度下土壤-蔬菜系统中ARGs的发生模式和关键驱动因素对于解决这一普遍的公共卫生问题至关重要。本研究通过盆栽实验，分析了土壤、根部和叶片中的ARGs分布，并探讨了细菌-真菌相互作用与ARGs分布之间的生态关联。结果表明，ARGs在蔬菜根部富集显著，土壤和蔬菜组织中ARG亚型的高度重叠表明两者之间的抗性组（resistome）存在密切联系。施用动物粪便衍生的肥料显著增加了根部的总ARGs含量和高风险ARGs的比例，同时增强了细菌-真菌的共存模式。含有Bacillus和Trichoderma的生物有机肥料显著增加了叶片中的ARGs含量，这与潜在的ARG宿主与高丰度ARGs之间存在强相关性。Proteobacteria、Gemmatimonadota和Planctomycetota被鉴定为可能的ARG宿主细菌类群。土壤中的细菌群落组成更符合中性群落模型，并且与真菌群落的关联显示出更高的网络复杂性。细菌-真菌相互作用、移动遗传元件和土壤性质共同影响了土壤抗性组及植物相关ARGs的模式。本研究加深了我们对土壤-蔬菜系统中ARGs生态分布和调控机制的理解，为评估有机施肥实践下的抗性组相关风险提供了宝贵见解。
引言
由于有机肥的广泛使用，兽用抗生素和抗生素抗性基因（ARGs）被引入农业生态系统，加剧了全球公共卫生问题[1]、[2]、[3]。最新研究表明，ARGs的增加是与人类活动（尤其是农业实践）相关的新兴全球变化因素[4]。农业栖息地作为ARGs的重要储存库，其ARGs含量高于非农业环境，而有机施肥常常导致ARGs水平升高[5]、[6]。尽管人们越来越认识到农业土壤是ARGs的储存库，但关于土壤相关抗性组在可食用植物组织中的存在程度及其对人类健康的潜在影响知之甚少。先前的研究已经证明，在施用粪便基肥料后，土壤-蔬菜系统中的ARGs显著增加[7]。蔬菜是环境抗性组与人类微生物组之间的直接接口，使得植物相关的ARGs成为通过饮食暴露于抗菌素抗性的潜在途径。在“同一健康”框架下，ARGs在土壤-植物-人类界面中的存在和传播引起了越来越多的关注，因为来自农业环境的ARGs可能最终会与人类微生物组相互作用。
以往在田间和盆栽实验中进行的研究记录了土壤-植物生态系统中ARGs的发生和潜在转移。一项温室实验揭示了土壤与生菜组织之间抗生素抗性组的显著重叠，并提出了内部和外部传播途径的存在[8]。一项关于生菜种植的田间试验表明，施用粪肥改变了表层土壤中的ARGs分布，而对内层土壤中的ARGs影响相对有限[9]。在幼苗阶段富集的ARGs倾向于在土壤和稻谷中被检测到，表明抗性组的潜在移动性[10]。关于土壤-植物系统中ARGs分布的研究还考察了多种施肥制度和多种蔬菜品种的影响[11]、[12]、[13]。鉴于ARGs通过蔬菜消费可能对人类健康产生的下游影响，研究其分布模式和驱动因素尤为重要。
越来越多的证据表明，土壤-蔬菜系统中ARGs的发生和分布受到各种施肥策略的影响。不同的有机施肥制度形成了不同的微生物群落、养分谱型和生态选择压力。动物粪便衍生的肥料可以直接引入携带ARG的细菌，而植物衍生的肥料主要改变土壤养分状况，生物有机肥料则进一步引入功能性微生物，重塑微生物群落相互作用。这些差异可能对抗性组的持续性和生态分布产生不同的影响。一项研究表明，长期使用动物粪便加剧了典型农业土壤中抗性组的选择压力[14]。然而，有机肥料促进的Bacillus生物膜形成抑制了耐药细菌，从而降低了ARGs的持续性和传播可能性[15]。使用植物基肥料还可以增强土壤抵抗力，并表现出与施用粪肥不同的ARGs富集模式[16]。生物有机肥料通常添加了Trichoderma属或Bacillus属等生物控制剂，这些生物控制剂有助于提高作物产量、养分利用效率和食品安全[17]、[18]。Trichoderma是一种广泛用作植物病原体直接生物控制剂的子囊菌，它能够从对抗作用转变为与有益Bacillus物种的共存相互作用，从而有助于抑制疾病和促进作物生长[19]、[20]。生物有机肥料可以通过改变土壤细菌和真菌群落的结构和功能间接抑制Fusarium枯萎病[21]、[22]、[23]。此外，生物有机肥料可以增加土壤养分，从而增强植物对环境压力的抵抗力[24]。考虑到细菌是ARGs的主要宿主，施肥引起的土壤性质变化及其相关的土壤微生物组变化可能会影响携带ARG的细菌群落的组成和活性。先前的研究表明，肥料类型（特别是Trichoderma改良肥料）可以通过重塑细菌群落和土壤性质来调节土壤中的ARGs含量[25]。然而，现有研究主要集中在土壤系统上，而Trichoderma对植物组织中ARGs发生的影响仍不清楚。此外，生物有机肥料相对于传统有机肥料在改变ARGs分布方面的作用程度尚不明确。
农业实践可以通过影响微生物群落组成、改变移动遗传元件（MGEs）的动态以及调节土壤物理化学性质（如土壤pH值、总碳（TC）和总氮（TN））来改变ARGs的分布。研究表明，施用粪肥后，细菌的适应性进化显著增强了ARGs在土壤-植物系统中的传播潜力[26]、[27]、[28]。细菌-真菌相互作用也可能起到关键作用，因为细菌的适应性进化变化可以由真菌群落介导[29]。先前的研究表明，真菌群落可以通过影响土壤和叶层中的细菌群落结构间接影响ARGs分布[30]。多项显微研究表明，在土壤动物群的肠道中，真菌在ARGs变异中可能比细菌发挥更重要的作用[31]、[32]。MGEs（如整合子和转座子）在通过促进微生物宿主间的水平基因转移而在环境中传播ARGs方面起着关键作用[33]、[34]。关于非生物因素，宏基因组组装基因组分析表明，酸性土壤富含多重耐药外排泵抗性基因，且ARGs含量强烈依赖于土壤pH值[35]。在流域尺度上，土壤pH值在塑造空间ARGs分布方面比养分可用性起着更主导的作用[36]。施用粪肥的土壤增强了微生物碳代谢，增加了ARGs的增殖和传播频率[37]。相反，长期使用化学肥料导致的碳缺乏会加剧微生物竞争，从而增加ARGs含量[38]。可利用养分的增加（如土壤无机氮含量）通常与潜在微生物宿主的变化相关，导致ARGs含量升高[39]、[40]。然而，特别是在不同施肥制度下，土壤-蔬菜系统中ARGs发生和分布的关键驱动因素仍不清楚。
基于上述情况，我们进行了温室盆栽实验，使用SmartChip高通量qPCR和测序技术，分析了不同有机肥料制度下土壤、根部和叶片中ARGs的分布模式及其相关关键因素。本研究的目标是：（1）阐明植物衍生有机肥料、动物粪便衍生有机肥料和生物有机肥料施用下土壤-根-叶片各部分的ARGs分布模式；（2）探讨细菌-真菌群落相互作用及其对不同施肥制度下ARGs分布的影响；（3）识别与ARGs分布变化相关的生物和非生物因素。
实验设计
从南京农业大学野外站（31° 38′N, 119° 58′E）的一个长期休耕地表层（0-15厘米）采集了土壤样本。土壤pH值为5.6，TC和TN含量分别为1.5%和0.14%。土壤在使用前进行了均质处理并储存了几周。盆栽实验设置了四种处理方式，每种处理有五个重复组：蔬菜残渣衍生有机肥料（VOF）、动物粪便衍生有机肥料
土壤-蔬菜系统中的ARGs模式
在BOF处理下，土壤中的ARGs含量降低，其中多重耐药基因和整合子是最丰富的ARGs类型。相应地，四环素和MLSB耐药基因在蔬菜组织中的含量最高，根部总ARGs含量高于土壤和叶片。具体来说，AOF处理后根部的ARGs含量显著高于其他肥料处理组（P <
土壤-蔬菜系统中ARGs的存在
总体而言，土壤-蔬菜系统中ARGs的存在和积累对人类健康构成了重大威胁，因为食物链是主要的暴露途径[56]。我们的研究结果表明，土壤、根部和叶片中的ARGs分布模式存在显著差异（图1）。在施用粪肥的土壤中，ARGs水平持续升高，并能在较长时间内保持较高水平，构成重要的环境储存库
结论
本研究系统地阐明了有机施肥下土壤-蔬菜系统中ARGs的分布模式及其关键驱动因素，特别强调了细菌-真菌相互作用。结果表明，有机肥料的应用促进了ARGs在蔬菜组织中的传播和积累。在蔬菜残渣衍生和动物粪便衍生肥料处理下，蔬菜根部的ARGs含量较高，而生物有机肥料处理则
环境影响
蔬菜组织中抗生素抗性基因（ARGs）的存在对“同一健康”框架下的人类健康构成了重大威胁。揭示ARGs的分布模式及其关键生态驱动因素对于制定有效的缓解策略以管理蔬菜生产系统中的抗性组至关重要。本研究调查了不同有机肥料类型下土壤-蔬菜系统中的ARGs模式，识别了与ARGs分布相关的关键因素
CRediT作者贡献声明
Jie Wu：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、资金获取、正式分析、概念构建。Muqing Zhou：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、正式分析、概念构建。Jingran Zheng：研究。Sujin Feng：研究。Zhaoqiang Han：研究。Jinyang Wang：撰写——审稿与编辑、监督、概念构建。Jianwen Zou：撰写——审稿与编辑、监督、概念构建。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（42507402）和江苏省优秀博士后人才资助计划（2025ZB682）的支持。
