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本文通过电生理、神经解剖和病毒示踪技术，系统揭示了小鼠腹外侧和腹内侧延髓（VLM/VMM）的交感前神经元不仅接受GABA能抑制，还接收来自甘氨酸能神经元（以甘氨酸转运体2（GlyT2）为标记）的单突触输入，且该输入同时释放GABA与甘氨酸两种抑制性神经递质。研究进一步发现，增强网络活动可促进甘氨酸释放，而持续的甘氨酸释放依赖于GlyT2介导的再摄取。此外，研究明确了腹侧脑干中GlyT2表达神经元的定位，并证实VLM/VMM神经元表达甘氨酸受体（GlyR）的α1、α3与β亚基。这些发现强调了在交感神经活动调控中，GABA能与甘氨酸能抑制共同作用的必要性，为理解相关神经环路提供了新的视角。
引言：脑干头端的双重抑制调控
在中枢神经系统中，γ-氨基丁酸（GABA）与甘氨酸（Glycine）是主要的抑制性神经递质。它们通过作用于离子型受体（氯离子通道），导致神经元超极化，从而抑制其活动。越来越多的证据表明，在脊髓、背侧耳蜗核、外展核以及延髓腹外侧/腹内侧区（VLM/VMM）等多个脑区，GABA与甘氨酸存在共释放现象。位于腹侧脑干的交感前神经元是调控交感神经活动的关键中继站，它们接收来自高级脑区的下行输入，并将信息传递给脊髓的交感节前神经元。以往的研究主要强调了GABA能抑制在VLM/VMM交感前神经元中的主导作用，而甘氨酸能输入的具体来源、释放机制及其功能意义尚不明确。
方法：综合技术揭示神经连接与功能
为了探究上述问题，研究团队运用了多学科技术组合。首先，他们构建了GlyT2Cre小鼠，并将其与表达光敏感通道蛋白2（ChR2）的小鼠杂交，获得了GlyT2ChR2/EYFP小鼠模型。这使得研究人员能够通过光刺激选择性激活表达GlyT2的神经纤维。同时，为了特异性标记VLM/VMM中的交感前神经元，研究人员向小鼠左肾注射了逆行转运的伪狂犬病毒（PRV-614）。在脑片制备中，对PRV标记的神经元进行了全细胞膜片钳记录，以分析其抑制性突触后电流（IPSCs）。此外，研究还结合了单突触和跨突触病毒示踪技术来确定甘氨酸能神经元的位置，并采用免疫荧光染色检测了VLM/VMM神经元中甘氨酸受体不同亚基的表达。
结果一：自发性抑制性电流由GABA与甘氨酸共同介导
对PRV标记的交感前神经元的电生理记录显示，其自发性抑制性突触后电流（sIPSCs）在应用GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱（Bicuculline）后，频率和平均相位电流（Iphasic）均显著下降，表明约40%的抑制性电流由GABA介导。剩余的约60%的sIPSCs对荷包牡丹碱不敏感，但可被甘氨酸受体拮抗剂士的宁（Strychnine）完全阻断，证实了甘氨酸能电流的存在。
有趣的是，当使用钾通道阻滞剂4-氨基吡啶（4-AP）增强整体网络兴奋性时，即使在荷包牡丹碱存在的情况下，甘氨酸能sIPSCs的频率和幅度也大幅增加。这表明增强的神经元活动能够促进甘氨酸的释放。
结果二：光刺激甘氨酸能纤维触发GABA与甘氨酸共释放
为了直接研究甘氨酸能输入，研究人员对GlyT2ChR2/EYFP小鼠VLM/VMM脑片中的GlyT2表达纤维进行光刺激。结果显示，光刺激在67%的记录神经元中诱发了抑制性突触后电流（eIPSCs）。应用荷包牡丹碱可部分降低eIPSCs的幅度和电荷转移量，而随后联用荷包牡丹碱与GlyT2选择性抑制剂ORG25543则进一步降低了反应幅度。最终，士的宁完全阻断了剩余的eIPSCs。这一系列药理学实验证明，光刺激诱发的电流是由GABA和甘氨酸共同释放产生的，并且GlyT2介导的甘氨酸再摄取对于维持甘氨酸能神经传递至关重要。
结果三：证实单突触连接与短时程可塑性
通过应用河豚毒素（TTX）阻断电压门控钠通道，光诱发的eIPSCs被取消；而随后联用TTX和4-AP则部分恢复了eIPSCs，并伴有反应延迟的增加。这一经典实验证实了GlyT2表达神经元与交感前VLM/VMM神经元之间存在直接的、单突触连接。
此外，研究还探讨了甘氨酸能突触的短时程可塑性。对GlyT2纤维进行连续光刺激（脉冲间隔50毫秒）时，观察到了明显的突触抑制，表现为后续脉冲诱发的电流幅度相对于第一个脉冲大幅下降。当脉冲间隔延长至2000毫秒时，这种抑制基本消失。重要的是，在单独使用荷包牡丹碱或ORG25543时，配对脉冲比率（PPR）未发生改变；然而，在荷包牡丹碱存在的情况下再应用ORG25543（即特异性抑制甘氨酸再摄取），则显著降低了PPR。这表明GlyT2的功能对于维持高频刺激下甘氨酸的持续性释放至关重要。
结果四：定位甘氨酸能神经元并鉴定甘氨酸受体亚基
通过向GlyT2Cre小鼠VLM区注射Cre依赖的逆行AAV病毒（pAAV-hSyn-DIO-EGFP），研究人员在腹侧脑干，特别是外侧旁巨细胞核和B?tzinger复合体区域，观察到了大量表达绿色荧光蛋白（EGFP）的甘氨酸能神经元胞体。将此项技术与肾注射PRV-614相结合，还发现了一些同时表达EGFP（甘氨酸能）和红色荧光蛋白（RFP，交感前）的双标神经元，进一步支持了局部甘氨酸能神经元对交感前神经元的投射。
免疫荧光染色结果显示，VLM/VMM区域的交感前神经元表达甘氨酸受体的α1、α3和β亚基。其中，α1亚基的免疫反应阳性点状信号广泛分布在神经元的树突区域，而α3亚基的免疫反应则更多集中在神经元胞体，提示这两种亚基在细胞上的分布可能存在功能分区。
讨论：双重抑制的生理意义与未来展望
本研究系统地证实了小鼠腹侧脑干中，表达GlyT2的神经元依赖GABAA受体和甘氨酸受体共同产生抑制性突触后电流。这些神经元直接向交感前VLM/VMM神经元提供单突触输入，并同时释放GABA和甘氨酸两种递质。甘氨酸的释放可随网络活动增强而增加，且其持续性释放严格依赖于GlyT2转运体对甘氨酸的再摄取回收。
这一发现具有重要的生理意义。在听觉脑干核等区域，GABA和甘氨酸的共释放被认为可以精细调节抑制的强度与时间特性。在本研究关注的交感神经调控环路中，双重抑制可能发挥着类似的作用：GABA可能负责设定神经元的兴奋性阈值，而甘氨酸则在突触活动增强时提供更强的抑制效能。此前在大鼠模型中的研究也提示，阻断甘氨酸受体会缩短压力反射介导的交感抑制时间过程，支持了这一假设。
总之，该研究不仅揭示了VLM/VMM区存在此前被低估的甘氨酸能抑制，更重要的是阐明了这种抑制与GABA能抑制交织共存的复杂图景。它强调在未来探讨交感神经输出的调控机制时，必须同时考量GABA能和甘氨酸能两种抑制性神经传递的作用。对相关神经环路和甘氨酸受体亚基功能的深入理解，可能为与交感神经活动异常相关的心血管疾病、呼吸障碍等疾病的机制研究与干预提供新的思路。
