基于苯并咪唑的抑制剂与Calliteara pudibunda（Linnaeus, 1758）乙酰胆碱酯酶之间的结构-活性关系研究

《Journal of the Indian Chemical Society》：Structure–Activity Relationship Insights into Benzimidazole-Based Inhibitors Targeting Calliteara pudibunda (Linnaeus, 1758) Acetylcholinesterase

苯并咪唑衍生物对树毛虫AChE抑制活性研究，合成8种新型化合物（2a-8a和2b-8b），IC50值4.5-6.2 nM，活性超参比药1000倍，SAR分析显示硫代半咔唑、三唑和硫代二唑结构显著增强抑制，硝基取代降低活性。

　　

Demet KIZIL

布尔萨技术大学中央研究实验室，土耳其布尔萨，16310

摘要

Calliteara pudibunda是欧洲和安纳托利亚森林生态系统中广泛存在的食叶害虫。这种害虫的周期性爆发造成了严重的生态和经济损失，这突显了需要寻找替代农药来管理它的必要性。 乙酰胆碱酯酶（AChE）是开发害虫控制剂的关键酶靶点；然而，针对C. pudibunda等森林害虫中这种酶的抑制作用的综合研究仍然有限。

在这项研究中，新合成的苯并咪唑衍生物（2a–8a和2b–8b）被评估了其对C. pudibunda AChE的抑制活性。这些化合物的抑制效果与参考抑制剂塔克里宁（tacrine）、依酚氯铵（edrophonium chloride）和氰戊菊酯（cypermethrin）在最佳条件下的效果进行了比较。IC₅₀值是通过至少三个独立实验的非线性回归确定的。所有化合物都表现出强烈的AChE抑制活性，其中大多数衍生物的效力达到了纳摩尔级别，并显著优于参考抑制剂。在测试的系列中，“a”衍生物（R = H）的抑制活性高于硝基（-NO₂）取代的“b”衍生物（R = –NO₂）。最有效的抑制作用出现在化合物6a（4.5 ± 0.3 nM）、8a（5.6 ± 0.3 nM）和7a（6.2 ± 0.4 nM）中，其活性比塔克里宁高出1000多倍。结构-活性关系（SAR）分析表明，硫代半卡巴嗪（thiosemicarbazide）、三唑（triazole）和噻二唑（thiadiazole）基团通过氢键和π–π堆叠相互作用显著贡献了抑制效力。苯并咪唑骨架的逐步功能化——从肼（hydrazide）到硫代半卡巴嗪和三唑/噻二唑衍生物——导致抑制活性系统性地增加，而吸电子的–NO₂取代基通常会降低酶的抑制作用。

这项研究首次详细表征了针对C. pudibunda AChE的苯并咪唑衍生物，并为合理设计具有潜在应用价值的新型杀虫剂酶抑制剂提供了概念验证框架。

引言

乙酰胆碱酯酶（AChE；EC.3.1.1.7）是一种关键的神经酶，通过水解神经递质乙酰胆碱（ACh）来调节神经传递[1]，[2]。神经传递对生物体的生存至关重要，它依赖于参与ACh合成、储存、运输和降解的蛋白质[3]，[4]。ACh由细胞质中的乙酰辅酶A转移乙酰基生成，然后释放到突触间隙，激活突触后膜上的受体以促进信息传递。ACh到达突触间隙后，会被AChE失活，AChE催化其水解，生成乙酸和胆碱。释放到突触间隙的胆碱被持续运输到胆碱能突触前神经元，这对调节记忆、学习、注意力、压力和感觉反应等重要的神经功能至关重要。突触间隙中ACh的过度积累会导致突触后膜过度兴奋，从而破坏信息传递[3]。AChE单体具有椭圆形结构，分子量约为60 kDa，由14个α螺旋和中央的12个β折叠片组成。酶的活性位点包含一个酯化亚结构域，其中包含催化三联体（Ser 200、His 440、Glu 327），以及一个由Trp 84、Phe 330和Phe 331定义的疏水亚结构域。活性位点位于一个深芳香路径的基部，该路径包含在不同AChE物种中高度保守的14个芳香残基，这些残基通过疏水性和静电作用帮助底物正确定位。此外，表面的外围阴离子区域在引导底物进入路径和活性位点方面起着关键作用[5]，[6]，[7]，[8]，[9]。酶的催化活性由位于活性位点的催化三联体Ser 200、His 440和Glu 327介导。乙酰胆碱通过芳香门和疏水亚位点导向活性位点，其正电荷四级结构得到稳定。Ser 200的羟基对羰基碳进行亲核攻击，导致胆碱部分断裂并形成乙酰丝氨酸中间体。在随后的水解步骤中，一个水分子被激活，将乙酰基从丝氨酸上移除，使Ser 200再次具有催化活性。这种机制使AChE能够高速且特异性地水解乙酰胆碱，有效终止神经传递[5]，[10]。

由于AChE在神经传递中的关键作用，它已成为杀虫剂、治疗药物和神经毒剂的重要靶点[11]。由于AChE的抑制作用导致突触中ACh的积累，可能会引起神经系统紊乱、神经元过度兴奋、神经传递抑制、瘫痪甚至死亡[2]，[11]，[12]。AChE抑制剂是通过抑制神经系统中ACh的分解来延长神经传递时间的化合物。在正常情况下，AChE会迅速在突触间隙中将ACh水解为胆碱和乙酸，从而终止神经冲动。然而，AChE抑制剂会抑制这种酶的活性，使ACh在突触间隙中停留更长时间，从而导致胆碱能受体的持续刺激和神经传递增强[3]，[11]，[13]。根据作用机制，抗胆碱酯酶被分为不可逆、伪可逆和可逆三类[14]。不可逆抑制剂与酶的活性位点共价结合，导致永久性抑制。有机磷化合物属于这一类，常被用作杀虫剂或神经毒剂。半可逆抑制剂与酶形成共价但可缓慢逆转的键。氨基甲酸酯衍生物也属于这一类，可用于医疗应用以产生可控的ACh增加。可逆抑制剂与酶弱结合，产生短暂的抑制作用。多奈哌齐（donepezil）、加兰他敏（galantamine）和利凡斯的明（rivastigmine）等药物属于这一类，用于治疗阿尔茨海默病[11]，[14]，[15]，[16]，[17]。从药理学角度来看，可逆AChE抑制剂如多奈哌齐、利凡斯的明和加兰他敏在阿尔茨海默病及相关神经退行性疾病的临床治疗中得到广泛应用[2]，[4]，[13]。尽管它们具有临床益处，但AChE抑制剂存在明显的毒理学问题，主要是由于过度刺激胆碱能系统。ACh的过度积累可能引发肌肉颤搐、呼吸抑制、心动过缓、抽搐，在严重情况下甚至会导致死亡（Ferreira等人，2021年）。合成杀虫剂如有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯利用了AChE的抑制机制。基于有机磷的抑制剂可以形成不可逆的酶复合物，导致永久性的神经功能障碍。此外，它们在环境中持久存在，会在生物体内积累，并对非目标生物产生毒性作用[18]，[19]。因此，AChE抑制剂的结构、动力学和毒理学特性一直是药理学和环境毒理学研究的主要焦点[1]，[4]，[12]，[20]，[21]，[22]。

Calliteara pudibunda（Linnaeus, 1758）（C. pudibunda）属于夜蛾科（Erebidae）下的Lymantriinae亚科[23]。这种蛾类通常被称为“淡色毛虫”，是欧洲已知的山毛榉害虫，也是一种重要的食叶害虫[23]，[24]。成熟的幼虫长度在35到50毫米之间，呈黄绿色，身体上有黄色毛发。它们的身体两侧有黑色条纹。幼虫主要以橡树（Quercus spp.）、桦树（Betula spp.）、山毛榉（Fagus spp.）和椴树（Tilia spp.）等树木的叶子为食，常常造成严重的叶片损失[25]，[26]。C. pudibunda广泛分布于欧洲42度至60度纬度之间，某些年份会引发森林树木的大规模害虫灾害[27]。1988年至1992年间，意大利西北部的各种山毛榉和混交阔叶林在海拔700–1300米处报告了这种淡色毛虫的爆发[28]。此外，瑞典、丹麦、德国和乌克兰也报告了大规模的虫害[24]，[29]。2005年，这种害虫首次在土耳其的Artvin省被发现，2019年在Bursa-?neg?l和Kütahya-Domani?地区造成了超过450公顷的山毛榉森林的严重破坏[25]。据估计，自2019年以来，这种害虫已经扩散到许多省份，将对马尔马拉海和黑海地区的森林生态系统构成越来越大的威胁[30]，[31]。

树木是一类多样的陆地植物，对提供生态系统服务起着关键作用。这些服务包括支持生物多样性、碳的封存、气候调节和生物多样性的维持[32]，[33]，[34]。森林生态系统是人类生活的基本组成部分[35]。昆虫害虫是导致植物物种生产力下降的最重要因素之一，过量的害虫种群会破坏森林生态系统的平衡[32]，[36]。除了农业生产过程中造成的经济损失外，用于管理这些生物的策略也会带来间接经济损失。这些损失与农药的采购和应用、农药对非目标生物和人类健康的负面影响以及环境污染造成的损害有关[1]，[36]。采取必要的预防措施以减少上述经济损失、确保生态系统的可持续性以及保护生态平衡和生态系统组成部分非常重要[35]，[37]。

近年来，杂环化合物对乙酰胆碱酯酶（AChE）的抑制潜力在多靶点药物设计方法中受到了广泛关注。在这方面，1,4-萘醌-噻唑杂合物被报道对AChE表现出纳摩尔级别的IC₅₀/K_I值（26.12–98.42 nM），其效果与经典胆碱酯酶抑制剂相当。同样，基于硫代半卡巴嗪的杂合支架也被报道对AChE表现出纳摩尔级别的IC₅₀/K_I值，其效果与分子的结构特性相关。此外，含有苯磺酰胺的杂环衍生物对代谢酶（包括AChE）的显著抑制作用表明，这些结构可能是多酶靶向的合适药效团。这些文献发现表明，对AChE具有低纳摩尔抑制潜力的杂合支架是在多靶点药物设计方法中的值得注意的候选者[38]，[39]，[40]。

尽管AChE是昆虫控制中常见的靶酶，但大多数研究仅限于模式生物和农业害虫；而像C. pudibunda这样的食叶害虫中AChE抑制剂的潜力尚未得到充分研究。在这项研究中，详细表征了新合成的苯并咪唑衍生物对C. pudibunda中AChE的抑制效果，并通过计算机模拟实验解释了这些化合物的作用。该研究旨在识别能够有效抑制这种周期性爆发的森林害虫AChE的替代化合物，以便对其进行控制。

材料

本研究中使用的化学品购自Sigma-Aldrich。C. pudibunda（Linneaus, 1758）标本采集自土耳其布尔萨Karacabey区?ahmelek地区平均海拔500米的纯山毛榉和山毛榉-橡树混交林中，并储存在-20°C条件下作为酶来源。如图1所示，新合成的苯并咪唑衍生物被用于酶抑制实验[41]。

酶测定

大约2克的C. pudibunda成虫被保存在液氮中

结果与讨论

所有合成的衍生物（2a–8a和2b–8b）都对其对C. pudibunda AChE的抑制活性进行了评估，并将结果与参考抑制剂塔克里宁、依酚氯铵和氰戊菊酯进行了比较。测得的IC₅₀值（表1）表明，所有设计的化合物都表现出比参考标准更高的AChE抑制效力，其中大多数衍生物的效力达到了纳摩尔级别（IC₅₀ = 2500–6500 nM）。

结论

本研究考察了新合成的基于苯并咪唑的衍生物（2a–8a和2b–8b）对C. pudibunda AChE的抑制特性。所有合成的化合物都表现出比参考标准塔克里宁、依酚氯铵和氰戊菊酯更强的抑制活性，大多数衍生物的IC₅₀值达到纳摩尔级别。在测试的化合物中，6a的抑制效果最强，其次是8a和7a，其活性提高了1000多倍

参与同意书

不适用。

出版同意书

不适用。

伦理批准

不适用。

数据和材料的可用性

处理后的数据可应要求向相应作者索取。

资助

本手稿的准备工作未获得任何资助。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我想感谢我在布尔萨技术大学中央研究实验室进行这项研究时得到的机构管理者的支持，感谢Musa ?zil博士合成苯并咪唑衍生物，感谢Mustafa Emirik博士进行计算机模拟研究，感谢O?uzhan Sar?kaya和Tutku Gencal在收集和鉴定C. pudibunda方面的帮助，以及我的家人的支持。