《Journal of Invertebrate Pathology》：Juvenile hormone enhances viral activity in bumble bees
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蜜蜂幼蜂激素（JH）通过提高代谢率促进病毒复制的阈值效应及组织特异性研究，发现JH水平升高显著增强以色列急性麻痹病毒（IAPV）在脂肪体和卵巢中的复制，但未影响大脑，且补充JH对已高JH水平的蜂后无效，免疫基因表达无变化。
阿萨夫·茨达卡（Assaf Tzdaka）|埃拉德·邦达（Elad Bonda）|亚当·G·多莱扎尔（Adam G. Dolezal）|诺尔·切贾诺夫斯基（Nor Chejanovsky）|哈盖·Y·施皮格勒（Hagai Y. Shpigler）
以色列里雄莱齐恩（Rishon LeZion）沃尔卡尼研究所（The Volcani Institute）农业研究组织（Agricultural Research Organization）昆虫学系
摘要
蜜蜂容易受到病毒感染，这可能会影响个体和整个蜂群的健康。由于病毒依赖于宿主细胞的资源进行复制，我们研究了关键昆虫调节因子——幼虫激素（Juvenile hormone，简称JH）对病毒活性的影响。JH能够促进繁殖和代谢率，我们假设高水平的JH会以组织特异性的方式促进病毒复制。为了验证这一假设，我们使用了大地熊蜂（Bombus terrestris）和以色列急性麻痹病毒（IAPV）。在第一个实验中，我们比较了处于休眠前和休眠后的蜂王体内的IAPV复制情况，这些蜂王的JH水平分别较低和较高。结果显示，休眠后的蜂王在脂肪体和卵巢中的病毒载量显著增加，而大脑中的病毒载量没有变化，这支持了我们的初步假设。为了确定因果关系，我们在感染前给休眠前的蜂王注射了JH。接受JH处理的蜂王在脂肪体和卵巢中的病毒转录本水平明显高于对照组，证实了JH确实增强了这些组织中的IAPV复制。第三个实验探讨了补充JH是否能够进一步促进已经具有高水平内源性JH的休眠后蜂王体内的病毒复制，但未观察到病毒滴度的额外增加，表明存在“上限效应”。我们的研究结果表明，JH特别在脂肪体和卵巢等代谢活跃的组织中增强了IAPV的复制。
引言
蜜蜂容易受到多种由病毒感染引起的疾病的影响。大多数研究和发现都集中在蜜蜂（Apis mellifera）上，因为它是农业中的重要传粉者，并且已经被人类饲养了几个世纪（Khalifa等人，2021年）。因此，许多病毒通常与蜜蜂相关联。一些常见的有害病毒包括以色列急性蜜蜂麻痹病毒（IAPV）、黑蜂王细胞病毒（BQCV）和畸形翅病毒（DWV）（de Miranda和Genersch，2010年；Chen等人，2014年；Faurot-Daniels等人，2020年）。然而，这些病毒也在熊蜂和其他蜜蜂物种中存在，并且会引起症状性感染（Singh等人，2010年；Peng等人，2011年；Fung等人，2018年；Alger等人，2019年；Arismendi等人，2021年；Dalmon等人，2021年；Pritchard等人，2021年）。病毒的经济和生态影响非常显著，因为病毒感染可能导致蜜蜂蜂群的崩溃，并感染野生蜜蜂种群（McMenamin和Genersch，2015年）。尽管人们已经做出了大量努力来全面理解和缓解病毒感染带来的挑战（de Miranda等人，2012年综述），但这些病毒的持续存在和造成的损害仍然非常严重（图1）。
尽管近年来人们对蜜蜂病毒的研究兴趣日益增加，但我们对宿主-病毒相互作用的理解仍然存在很大空白。其中一个方面是蜜蜂生理与病毒活性之间的关系。目前关于病毒受体及其与肠道受体相互作用的相关数据非常有限（Guo等人，2025年）。此外，只有少数研究探讨了病毒在蜜蜂组织中的定位（Chen等人，2014年；Wang等人，2018年）。总体而言，我们对解释和支持蜜蜂体内病毒活性的生理条件知之甚少（图2...）。
蜜蜂病毒感染在行为和分子层面都会产生广泛的影响。受感染的蜜蜂可能会改变其行为，以减缓疾病的发展或限制其在其他蜂群成员中的传播。在分子层面上，蜜蜂的免疫系统通过激活抗菌和抗病毒基因来应对感染。这种防御系统依赖于几种关键的信号通路，主要是RNA干扰（RNAi）机制以及Toll和Imd级联反应（McMenamin和Genersch，2018年；Grozinger和Flenniken，2019年）。此外，这些免疫通路受到内分泌系统的调节，内分泌系统可以根据蜜蜂的激素状态来调节免疫反应。例如，高水平的幼虫激素（JH）与蜜蜂的免疫抑制和抗病毒效应因子（如Vitellogenin）表达减少有关（Amdam等人，2005年）。激素是协调器官、组织、细胞和基因发育和活性的核心信号。激素参与机体对环境变化的适应，包括非生物因素（如温度波动、季节变化、昼夜周期）和生物因素（如饮食和社会环境）（Hamilton等人，2017年）。内分泌变化会引发许多生物反应，包括细胞活性、生理状态、代谢率和基因表达的变化（Riddiford，1980年）（图3）。
病毒是专性寄生虫，因此它们会受到宿主细胞内激素变化的影响。例如，性激素可以调节人类的COVID-19感染（Su等人，2022年），尽管并非所有研究都支持这一发现（Lott等人，2023年）。这种激素系统的影响也观察到了呼吸道病毒（Kadel和Kovats，2018年）。其他激素，如甲状腺激素，也会影响病毒感染（Roizman，1962a；Roizman，1962b）。病毒还可以操纵宿主的激素系统，例如杆状病毒编码一种蜕皮甾醇葡萄糖转移酶基因，该基因在感染期间表达时可以抑制宿主的蜕皮过程。这通过催化葡萄糖和半乳糖与蜕皮甾醇的结合来实现，从而干扰昆虫的正常蜕皮，导致昆虫进食时间延长和病毒后代数量增加（O’Reilly和Miller，1989年）。
内分泌系统是病毒环境的一部分，会改变宿主的生理状态。因此，我们认为激素状态的变化也会影响病毒的活性。为了验证这一假设，我们研究了蜜蜂及其病毒的关系。我们的研究重点关注了幼虫激素（JH）——昆虫体内的一种关键激素——以及以色列急性麻痹病毒（IAPV），这种病毒对蜜蜂和熊蜂都有威胁。JH控制着幼虫阶段的蜕皮和变态时间以及大多数成年昆虫的繁殖（Riddiford，2008年；Riddiford，2012年）。这些由JH控制的重要过程包括体内生理状态和资源分配的深刻变化。在某些昆虫物种中，尽管证据有限，但已经证明高水平的JH与病毒活性增加有关。例如，在鳞翅目昆虫的幼虫中，JH类似物的处理显著增加了病毒的复制（Lasa等人，2007年；Liao等人，2016年）。在埃及伊蚊（Aedes aegypti）中，JH处理增强了寨卡病毒的复制（Shi等人，2021年）。这些研究支持了病毒活性受JH水平影响的假设。然而，JH水平与病毒活性之间的关联尚未得到直接解释。此外，JH对蜜蜂病原体的影响也从未被直接研究过。
在之前关于大地熊蜂（Bombus terrestris）工蜂的研究中，发现高水平的JH可以促进卵巢发育、增加蜡质产量、加速代谢率、提高蛋白质周转率并减少脂肪储备（Bloch等人，2000年；Shpigler等人，2010年；Amsalem等人，2014a年；Shpigler等人，2014年；Pandey等人，2020年；Shpigler等人，2021年）。同样，JH或甲氧普伦（JH类似物）处理可以激活熊蜂蜂王的卵巢发育，但可能不足以激活产卵行为（Shpigler等人，2021年；Wynants等人，2023年）。许多这些反应是由脂肪体介导的，脂肪体是控制昆虫能量储存和代谢的中心器官（Arrese和Soulages，2010年）。在一项转录组研究中，发现JH在大地熊蜂工蜂中上调了脂肪体内的所有主要代谢途径，包括糖酵解、柠檬酸循环和氧化磷酸化。同时，JH下调了大脑核糖体基因的表达并增加了溶酶体基因的表达（Shpigler等人，2020年）。这些研究建立了JH与脂肪体细胞和卵巢活性之间的因果关系。高繁殖活动在代谢上要求很高，需要从非生殖相关组织（如大脑）获取营养。另一种可能的权衡是免疫系统活性的降低，这需要大量的蛋白质生产和能量消耗。当熊蜂投入繁殖时，它们可能会减少一些免疫系统主要蛋白质的生成（Amdam等人，2005年；Shpigler等人，2020年；Tibbetts等人，2020年）。这种重新分配和免疫基因活性的降低可能会降低机体对病原体的防御能力，增加感染风险。基于这些关于Bombus terrestris的研究，我们提出了一个问题：高水平的JH是否也会创造有利于IAPV活性的条件？
为了探索这一假设，我们对熊蜂蜂王进行了四项实验。在这些实验中，我们使用了处于休眠前和休眠后的蜂王，它们的JH水平自然较低和较高（Chen等人，2021年；Shpigler等人，2021年）。我们利用这些蜂王来追踪在控制JH处理和病毒感染后的病毒活性。我们预测高水平的JH会以组织特异性的方式促进病毒活性，在卵巢和脂肪体中的效果比在大脑中更明显，因为大脑对JH的反应更强。最后，我们测量了休眠前和休眠后蜂王脂肪体内的主要免疫基因的表达水平，以确定免疫系统的变化是否可以解释病毒复制率的变化。
材料与方法
大地熊蜂蜂王（Bombus terrestris）
我们使用Bombus terrestris蜂王进行实验。这些蜂王来自两个机构：Pol-Yam Pollination Services（Yad Mordechai – 以色列）和AgroBee（Ein Yahav – 以色列）。蜂王在这些机构中饲养和交配。实验使用了两组蜂王：第一组是休眠前的蜂王，年龄为一到两周；第二组是休眠后的蜂王，年龄为19-20周。
实验设计
实验1：熊蜂蜂王生命阶段对IAPV活性的影响
为了研究生命阶段对IAPV活性的影响，我们使用了80只蜂王：40只在休眠前阶段，40只在休眠后阶段。然后根据它们是否接触过活性或非活性IAPV病毒，将蜂王分为四组，每组20只。每组蜂王被放在五个笼子里，每个笼子里有四只蜂王。在第六天，从每个笼子里收集了一到两只蜂王。
结果
实验1：熊蜂蜂王生命阶段对IAPV活性的影响
注射了非活性病毒的对照组中，IAPV基因组的拷贝数水平可以忽略不计，这表明实验期间的蜜蜂没有感染病毒。我们在三个测试的组织中发现了休眠前和休眠后蜂王之间病毒拷贝数的显著差异：脂肪体（K-W检验，H = 20，p < 0.001），卵巢（ANOVA F(3,22)
讨论
在这项研究中，我们研究了蜜蜂体内病毒活性与内分泌系统之间的相互作用。我们的模型病毒是以色列急性麻痹病毒（IAPV）及其与关键昆虫激素——幼虫激素（JH）的相互作用。在第一个实验中，我们检查了休眠前和休眠后蜂王中的IAPV活性。休眠前的蜂王处于非繁殖阶段，自然表现出低水平的JH，而休眠后的蜂王进入繁殖阶段，JH水平升高。
作者贡献声明
阿萨夫·茨达卡（Assaf Tzdaka）：撰写原始草稿、进行研究、进行正式分析、数据管理。埃拉德·邦达（Elad Bonda）：监督研究、制定方法论、进行研究。亚当·G·多莱扎尔（Adam G. Dolezal）：撰写并编辑稿件、提供资源、制定方法论、提出概念。诺尔·切贾诺夫斯基（Nor Chejanovsky）：撰写并编辑稿件、进行监督、提供资源、制定方法论、提出概念。哈盖·Y·施皮格勒（Hagai Y. Shpigler）：撰写原始草稿、制定方法论、提供资源、进行监督、提出概念、争取资金、进行研究、管理数据、进行正式分析。
资助
这项研究得到了BARD基金（IS-5644-24）对HYS和AGD的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
我们想感谢Polyam Pollination Services的Yossi Sarid和AgroBee的Jonathan Cnaani在研究中的支持，以及他们在熊蜂饲养方面提供的宝贵建议。同时，我们也感谢Itzhak Sade在实验室中对蜜蜂维护的帮助，Tal Erez在病毒生产和qPCR分析方面的协助，以及Dr. Hillari Pot在统计分析方面的帮助。
