一种快速、特异的环介导等温扩增-侧向流动试纸条（LAMP-LFD）方法，用于检测Melissococcus plutonius菌，该菌是导致欧洲蜜蜂患腐臭病的病原体

《Journal of Invertebrate Pathology》：A rapid and specific loop-mediated isothermal amplification-lateral flow dipstick (LAMP-LFD) method for detecting Melissococcus plutonius, the causal agent of European foulbrood in honeybees

蜜蜂欧洲腐臭病病原体快速检测方法研究|蜜蜂|欧洲腐臭病|cLAMP-LFD|环介导等温扩增|侧流层析试纸条

　　

阿诺查·普姆芒（Anocha Poommouang）、法努蓬·昌托尔（Phanupong Changtor）、帕克吉拉·通苏特（Pakjira Tongsut）、皮拉亚·尼姆努安（Peeraya Nimnuan）、昂奇拉·里特班隆（Onchira Ritbamrung）、萨塔瓦特·多基昂（Satawat Dokkiang）、查伊纳隆·辛普（Chainarong Sinpoo）、帕查林·波卡森（Patcharin Phokasem）、邵康·黄（Shao Kang Huang）、特尔德·迪萨亚塔诺瓦特（Terd Disayathanoowat）、基蒂萨克·布达查特（Kittisak Buddhachat）

泰国披集奴洛克市纳瑞苏安大学（Naresuan University）理学院生物系，邮编65000

摘要

Melissococcus plutonius是一种革兰氏阳性细菌，会导致蜜蜂幼虫患上欧洲幼虫腐臭病（European Foulbrood，简称EFB），从而降低多个国家的蜂蜜产量。本研究基于gyrase亚基B（gyrB）和超氧化物歧化酶（sodA）基因的序列，开发了一种利用比色环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，简称cLAMP）与侧向流动试纸条（lateral flow dipstick，简称cLAMP-LFD）相结合的快速检测方法。该方法使用三种引物对（gyrB1、gyrB2和sodA）。在最佳条件（63°C）下孵育50分钟后，cLAMP-LFD能够特异性且灵敏地检测出M. plutonius，且不会与其他细菌发生交叉反应。检测限（LOD）为每反应2×10^4个细菌拷贝以及50个CFU（菌落形成单位）。在添加了M. plutonius的样本中，该方法成功地在蜜蜂幼虫和成年蜜蜂中检测到了该细菌，最低检测浓度分别为每反应11.4 CFU和80 CFU。我们的结果表明，基于gyrB的1cLAMP-LFD检测方法适用于养蜂场环境以及常规方法检测呈阴性的蜂蜜样本。总体而言，这种cLAMP-LFD检测方法快速、灵敏且特异性强，有助于全球范围内对EFB的监测、疾病控制和管理，从而提高蜂蜜生产效率。

引言

蜜蜂对全球经济至关重要，不仅是蜂蜜的主要来源，还是农业和园艺中的关键授粉者（Forsgren, 2010; Genersch, 2010）。然而，由于细菌、病毒、原生动物、真菌和寄生螨虫等多种病原体的影响，蜜蜂种群数量一直在下降（Forsgren, 2010）。其中，Melissococcus plutonius是导致欧洲幼虫腐臭病（EFB）的病原体，被认为是最具经济危害性的病原体之一，并与蜂蜜产量减少有关。

M. plutonius是一种需氧或厌氧环境下生长、且需要较高二氧化碳浓度的革兰氏阳性细菌。它是欧洲幼虫腐臭病（EFB）的主要原因，这种疾病严重影响西方蜜蜂（Apis mellifera）的幼虫（Arai et al., 2012）。该细菌已在墨西哥（de León-Door et al., 2018）、美国（Fowler et al., 2025）、瑞士（Belloy et al., 2007）、中国（Arai et al., 2012, Cai et al., 2025, Fowler et al., 2025）、韩国（Truong et al., 2023）和日本（Arai et al., 2012）等多个国家的蜜蜂种群中造成严重危害。M. plutonius会侵染幼虫的中肠，破坏营养吸收并导致幼虫死亡（Forsgren, 2010）。由于M. plutonius导致的幼虫存活率下降，蜂蜜、蜂蜡和蜂王浆的产量大幅减少，同时影响农业所需的授粉服务（Takamatsu et al., 2017, Budge et al., 2014）。随着世界对授粉和蜂产品依赖度的增加，有效控制这一病原体对于保护蜜蜂健康和维持生态系统稳定至关重要。

准确快速地检测M. plutonius对于有效管理EFB至关重要。传统方法（如从受感染幼虫或蜂巢样本中培养细菌）速度慢、劳动强度高且操作困难，因为该病原体在实验室条件下的生长能力较弱（Forsgren, 2010, Arai et al., 2012）。基于PCR的检测方法虽然灵敏度和特异性较高，但需要专用设备和专业技术人员，限制了其在实际应用中的使用（Nesvorna et al., 2020）。血清学方法往往无法实现早期诊断（Fierz, 2024）。为克服这些限制，环介导等温扩增-侧向流动试纸条（LAMP-LFD）检测方法应运而生，成为一种实用的分子检测手段。

LAMP-LFD是一种简单可靠的细菌、病毒和寄生虫检测工具。由于LAMP在恒定温度下进行扩增，无需复杂设备，因此比传统PCR更具实用性（Notomi et al., 2000, Mori and Notomi, 2009）。此前已有多项研究利用LAMP检测多种蜜蜂病原体，如M. plutonius（Nguyen et al., 2012, Chupia et al., 2016, Kato et al., 2020, Ackerly et al., 2024, Lannutti et al., 2025）、Paenibacillus larvae（Ackerly et al., 2024）、Nosema apis（Lannutti et al., 2025）、Nosema ceranae（Lannutti et al., 2025, Chupia et al., 2016）以及微孢子虫（Lannutti et al., 2025, Kato et al., 2020）。当LAMP与侧向流动试纸条结合使用时，其特异性更高，能够区分真阳性与假阳性（非特异性扩增产物），结果易于肉眼观察，适用于现场检测（Rolando et al., 2020, Buddhachat et al., 2024, Zhang et al., 2025）。因此，LAMP-LFD越来越多地被用于建立即时检测系统，例如检测食品样本中的大肠杆菌（Cui et al., 2024）和沙门氏菌（Yang et al., 2018）、临床样本中的结核分枝杆菌（Kaewphinit et al., 2013）、流感A病毒（H1N1）和呼吸道合胞病毒（RSV）（Zhang et al., 2025）、水稻中的黄单胞菌 pv. oryzae（Xoo）和黄单胞菌 pv. oryzicola（Xoc）（Buddhachat et al., 2024），以及水产养殖环境中的海链球菌（Wang et al., 2023）。

本研究旨在建立一种结合比色环介导等温扩增与侧向流动试纸条的检测方法（cLAMP-LFD），用于高效检测蜜蜂中的M. plutonius>，以构建实用的现场诊断系统。我们坚信LAMP-LFD可通过早期检测帮助改善EFB的管理，从而减少经济损失并保护蜜蜂种群。

部分内容摘要

细菌样本、DNA和标准质粒

Melissococcus plutonius（ATCC编号35311）在37°C的厌氧条件下于血液琼脂培养3天。为验证特异性，从清迈的一个养蜂场收集的蜜蜂幼虫中分离出Paenibacillus larvae，并在37°C的LB琼脂中培养。其他细菌包括Enterococcus faecalis（ATCC29212）、Escherichia coli TISTR 527株、Bacillus cereus TISTR 035株、Staphylococcus epidermidis TISTR 518株、Citrobacter freundii TISTR 1868株等。

LAMP条件优化

为了获得最佳的LAMP扩增条件，我们使用不同的引物（gyrB1、gyrB2和sodA）测试了多种温度和孵育时间。结果表明，所有引物组合在60°C和63°C下均能产生梯状条带图案，而使用gyrB2的LAMP在65°C时也能产生梯状条带图案（图3A）。不过，所有引物组合的LAMP产物在63°C时的强度最为明显。

讨论

M. plutonius作为EFB的致病菌，已在全球范围内造成严重的蜂蜜产量损失（Arai et al., 2012, Budge et al., 2014, Takamatsu et al., 2014, Mallory et al., 2024）。现有的检测方法（如显微镜观察、培养、扫描电子显微镜观察、ELISA和PCR）通常灵敏度较低且操作复杂（Forsgren, 2010, Arai et al., 2012, Nesvorna et al., 2020; Fierz, 2024; Budge et al., 2024）。本研究开发了LAMP-LFD方法，以便在现场快速检测M. plutonius

结论

我们成功开发了一种基于gyrB1的快速、灵敏且特异性的LAMP-LFD检测方法，可用于检测蜜蜂幼虫和蜂蜜样本中的M. plutonius>。该方法无需DNA提取，检测限分别为每反应11.4 CFU（幼虫）和80 CFU（蜂蜜），检测时间仅需1小时，非常适合现场诊断。尽管该方法无法区分典型的和非典型的M. plutonius菌株，但仍能提供有力的检测结果。

撰写过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本手稿期间，作者使用ChatGPT辅助英文编辑以提高可读性。随后，作者对内容进行了全面审查和修改，并对最终出版物承担全部责任。

未引用参考文献

Fierz, 2004; Habib et al., 2024; Lannutti et al., 2022; Mallepaddi et al., 2018; Njiru, 2012; Parida et al., 2008; Prompamorn et al., 2011; Srimongkol et al., 2020; Tran et al., 2021.

CRediT作者贡献声明

阿诺查·普姆芒（Anocha Poommouang）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、数据分析、数据整理。法努蓬·昌托尔（Phanupong Changtor）：项目管理、资金申请、概念构思。帕克吉拉·通苏特（Pakjira Tongsut）：方法设计。皮拉亚·尼姆努安（Peeraya Nimnuan）：方法设计。昂奇拉·里特班隆（Onchira Ritbamrung）：方法设计。萨塔瓦特·多基昂（Satawat Dokkiang）：方法设计。查伊纳隆·辛普（Chainarong Sinpoo）：监督工作、资源协调。帕查林·波卡森（Patcharin Phokasem）：监督工作、资源协调。邵康·黄（Shao Kang Huang）：监督工作。特尔德·迪萨亚塔诺瓦特（Terd Disayathanoowat）：

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了泰国纳瑞苏安大学（Naresuan University）的资助（项目编号：R2569C038）和泰国纳瑞苏安大学的“全球与前沿研究大学基金”（项目编号：R2566C051）的支持。此外，还得到了“湄公河-韩国合作基金”（MKCF，项目编号：C8-THA01）的资助（该基金隶属于湄公河研究所（Mekong Institute）。

作者贡献

基蒂萨克·布达查特（Kittisak Buddhachat）、法努蓬·昌托尔（Phanupong Changtor）和特尔德·迪萨亚塔诺瓦特（Terd Disayathanoowat）负责实验设计和项目管理工作。